[发明专利]鸭CCL4基因启动子的克隆及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程应用和分子生物学技术领域，具体涉及一个鸭CCL4基因启动子的扩增和对 其转录活性的鉴定。

背景技术

基因的表达受一段位于其5’端上游的DNA序列控制，该5’端上游序列可被转录因子和RNA酶识别， 进而启动基因的转录，该5’端上游序列通常被称为启动子。利用启动子可以诱导蛋白在特定的时间、部位 和特定条件下表达。

启动子是重要的顺式作用元件，在该段序列中存在一些特定序列被转录因子识别并结合，这段序列决 定基因的表达特异性和表达频率。启动子一般可分为三类：1、组成型启动子，该类启动子调控基因表达 不受时空的限制；2、诱导型启动子，即在诱导剂的作用下启动子才诱导基因表达；3、组织特异性启动子， 即该类启动子在不同的组织调控的基因表达存在差异。

在植物中，人们利用组织或时期特异的启动子生产不同的产品取得了丰富的成果，如抗虫棉花等。同 样在大型动物中也取得了一定的成效，如利用乳腺特异的启动子指导药用蛋白在乳腺中超表达，可使基因 工程药物产业化。黄赞等成功利用山羊的β-酪蛋白基因的启动子指导人凝血因子IX在转基因小鼠乳汁中 高效表达。

我国是鸭肉消费大国，近年来我国养鸭业不断发展，鸭的生产性能在不断选育下大幅提 高，主要表现为生长速度快，料肉比低，产蛋率高。但随着鸭生产性能的提高，养殖规模的 扩大，养鸭业也面临着各种疾病的威胁，如禽流感、鸭病毒性肝炎、传染性浆膜炎等，鸭的 成活率大幅降低。通过提高生产管理水平或使用药物和抗生素可在一定程度上减少损失，但 并不能从根本上解决问题，同时药物和抗生物的使用容易引起兽药残留、增加食品安全风险。 通过对鸭的抗病性进行研究，通过基因改良手段培育出适应当前生产环境，具有一定抗病力 的鸭品种前景将极为广阔。但能用于转基因鸭制备且拥有自主知识产权的高效表达的启动子比较少， 大大限制了转基因鸭的发展，因此，获得转录效率较高的启动子成为急需解决的问题。因此本发明旨在构 建获得适合在免疫组织中高效表达的启动子。

趋化因子是一系列小分子蛋白质，主要在免疫组织中表达，通过受体介导粒细胞、单核/巨噬细胞、淋 巴细胞、成纤维细胞的趋化性迁移和活化，从而使细胞在炎症部位具体、活化以及组织损伤的修复等。CCL4 是CC家族的一员，属前炎症趋化因子，在受体介导下，CCL4能吸引单核细胞、T淋巴细胞和嗜曙红细胞， 此外它还可能是机体清除有害微生物至关重要的因子。

到目前为止，仍没见到研究鸭CCL4基因的启动子功能的报道。所以申请人对这个基因进行了不同长 度启动子功能的研究，以期能够更好地利用该启动子。

发明内容

本发明的目的在于分离克隆鸭CCL4基因启动子区域，并构建不同长度的启动子缺失片段，对其转录 活性进行验证，以期获得此基因启动子的具备较高启动转录活性的调控区段。克服目前鸭基因工程中可利 用的启动子数目的不足。

本发明以鸭的血液基因组DNA为模板首先扩增获得CCL4基因第一外显子上游543bp的片段，通过 测序验证其正确性，通过软件预测其是否可能为该基因的启动子。然后以扩增获得的片段为模版扩增获得 了CCL4基因第一外显子上游区域的817bp、631bp、554bp、397bp、295bp共5个不同长度的缺失片段， 将这些片段插入到萤火虫荧光素酶报告系统中构建pGL3-C1、pGL3-C2、pGL3-C3、pGL3-C4、pGL3- C5个真核表达载体，将这些载体分别转染鸡的淋巴瘤DT40细胞，通过对报告系统的萤火虫荧光素酶的相 对活性进行分析，比较不同缺失片段的相对活性，通过分析确定扩增的上述片段为启动子区域，并获得该 基因的核心启动子区域。

本发明通过以下技术实现：