[发明专利]一种培养转基因动物胚胎细胞或转基因动物的方法及培养基

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养转基因猴的方法及培养基。

技术背景

动物疾病模型在研究人类疾病致病机理和药物筛选中起到了关键作用。建立动物 模型的基因编辑方法主要有转基因和基因打靶。转基因即用人工方法将外源基因导入或整 合到基因组内，并能够稳定传给下一代。但依赖于病毒方法对动物进行遗传学修饰也有一 定的局限性，即被转入基因的随机插入使得突变位点无法预知，突变数量无法控制，从而限 制了动物模型的建立。而基因打靶技术是指通过内源性DNA定点重组，改变基因组中的某一 特定基因从而在生物活体内研究该基因的功能，如传统的同源重组技术、重组酶Cre介导的 位点特异性重组技术、锌指核酶技术(zinc-fingernucleases)、TALEN(transcription activator-likeeffectornuclease)技术及近年以来备受关注的CRISPR/Cas9技术等。

传统的基因打靶技术依赖于胚胎干细胞系，首先在体外培养的胚胎干细胞系中进 行基因打靶，然后将打靶后的胚胎干细胞移植入动物母体，让其发育成带有突变基因的动 物。然而目前只有鼠的胚胎干细胞系可用于基因打靶技术。对于大多数物种，基因修饰仍依 赖于直接使用动物的胚胎细胞，效率低并且费用昂贵。提高胚胎细胞中基因修饰的效率是 成功建立动物疾病模型的关健。近年来发展的锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因 子核酸内切酶(TALEN)技术和基因编辑新技术CRISPR/Cas9等人工内切酶使得编辑任基因 组意位点的问题得以实现。TALEN(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease) 转录激活子样效应因子核酸酶技术，克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以 及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，但TALENs蛋白分 子量过大往往会给分子操作带来不便，不但增大与靶基因结合难度，构建复杂，而且在生物 体内也可能产生其它影响。

近两年发展出的CRISPR/Cas9技术使得在所有物种中实现基因组编辑成为可能。 CRISPR/Cas9是一种来源于细菌获得性免疫的由RNA指导Cas9蛋白对基因进行编辑和修饰 的新技术。Jinek等对CRISPR/Cas9系统进行人工改造使得该系统能够更简单方便地用于基 因编辑(Jineketal.,2013)，且能够实现将一对等位基因进行剪切得到纯合突变，还可在 目的基因的多个位点设计多种gRNA以完全敲除目的基因。目前，RNA介导的Cas9系统能够成 功介导细菌、植物细胞、斑马鱼胚胎、小鼠、人源细胞、非人灵长类动物食蟹猴胚胎、甚至人 类废弃胚胎等的基因组编辑(Choetal.,2013；Congetal.,2013；Jineketal.,2013； Malietal.,2013；Niuetal.,2014；Plattetal.,2014；Shanetal.,2013)，为未来应 用于人类遗传缺陷疾病的治疗提供了希望。

转基因技术及TALEN、CRISPR/Cas9等基因打靶技术的飞速发展使得动物疾病模型 的建立不再局限于少数的模式生物。但这些技术目前也都存在基因突变嵌合多态性、基因 敲入同源重组效率较低等不足之处。对于基因修饰的嵌合效应问题，小动物模型因生长周 期较短可通过不断杂交传代而得到纯合突变体。但对于大动物而言，如与人类较为接近的 灵长类动物，其性成熟时间就需要4到5年，妊娠时间长达165天，且目前尚缺乏有效的猴胚 胎干细胞系，因此嵌合效应的存在使建立纯合基因突变猴等大动物模型具有巨大挑战性。