[发明专利]在升高的温度下合成肽的改进偶联方法

说明书

技术领域

本发明涉及肽合成，并特别涉及改进的固相肽合成(solidphasepeptidesynthesis,SPPS)的活化和偶联，其以更高速率进行，产生更少不期望的副反应，并且生成更好结果。

背景技术

固相肽合成包括当另外的氨基酸被添加到生长肽链时而重复的若干基本步骤。―固相‖指起始氨基酸(之后生长肽链)附着的树脂颗粒。由于链附着到颗粒，所以链就像是固体颗粒的集合那样被处理(特别是对于洗涤和分离(例如，过滤)步骤)，并因此使整个过程在多数情况下比纯溶液合成更容易。

SPPS的重复步骤包括脱保护、活化和偶联。脱保护：在各循环开始之前，肽链上最后的酸保持―被保护‖，即，其―氨基‖端连接到防止酸发生不希望反应的官能团。当即将添加下一氨基酸时该―保护基团‖由此被除去(―脱保护‖步骤)。

活化：向反应中添加化合物(―活化剂‖)以生成中间氨基酸物质，其更易于偶联到肽链上脱保护的酸。

偶联：活化的物质连接到已有肽链。

碳二亚胺活化法

或许最常使用且被研究的肽合成活化法均基于碳二亚胺的使用。它们在肽合成中的使用追溯到1955年，其中N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)被用于促进酰胺键形成。碳二亚胺包含两个弱碱性氮原子，其将与氨基酸衍生物的羧酸反应形成如图1所示的高度反应性的O-酰基异脲。然后形成的O-酰基异脲可与胺立即反应形成肽键；即，图1中水平显示的路线。可选地，O-酰基异脲可转化或被转化为其它活性物质。

然而，O-酰基异脲的这些可选的反应中的某一些会促进不期望的途径，其可能导致或可能不会导致肽键形成，这些不期望的途径也显示于图1中。向非反应性N-酰基脲的转化(图1中，左下方)防止偶联，而通过噁唑酮形成可发生活化的手性氨基酸的差向异构化(右下方)。通过使用与碳二亚胺相比过量的氨基酸可形成更加期望的高度反应性的对称酸酐(图1，左上方)。然而，该方法不期望地消耗额外的氨基酸当量。

随着在碳二亚胺活化期间1-羟基苯并三唑(HOBt)作为添加剂的掺入，出现了碳二亚胺活化法的重大改进。HOBt迅速地将O-酰基异脲转化为高度反应性OBt酯(图1，右上方)，而避免不期望的N-酰基异脲和噁唑酮形成。随后表明1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)由于7-位氮的邻基效应而是HOBt的有利替代物[161]。许多其它添加剂可被用于代替HOBt和HOAt，列举若干常见实例，例如，6-氯代-1-羟基苯并三唑(6-Cl-HOBt)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma，OxymaPure，ECHA)和1-羟基-2,5-吡咯烷二酮(NHS)。

典型地，与氨基酸和碳二亚胺的量相比使用1当量的添加剂。然而，最近的研究揭示，添加剂的量降至低于1当量可能是有用的；S.Nozaki,Delayofcouplingcausedbyexcessadditives,J.Pept.Sci.,vol.12,pp.147-153,2006。作者发现通过胺和添加剂之间的盐形成可妨碍酰化反应。然而，作者还发现，添加剂降至低于1当量减慢了活化速率并略微增加片段偶联中的差向异构化。

N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)作为优选的用于肽活化的碳二亚胺已很大程度上代替了DCC。DCC不期望地产生仅在TFA中可溶的脲，进而使其难以用于Fmoc化学。另外，DCC为难以处理并且已报道引起变态反应的蜡质固体。可选地，DIC提供改进其生成的脲在有机溶剂中的溶解度、报道的变态反应发生率更低以及相对低成本的优点。DIC/HOBt的组合由于其低成本并最小化副反应同时常规地提供有效偶联而流行。

1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(―EDC‖)代表另一流行的选择，并且这些反应的大多数使用DCC、DIC和EDC的一种或多种来进行。