[发明专利]一种金黄色葡萄球菌膜泡展示系统及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌膜泡展示系统，所述展示系统将任选靶蛋白的编码核苷酸序列插入到锚定蛋白的编码基因的终止子前，表达的融合蛋白将所述靶蛋白展示于金黄色葡萄球菌的膜泡表面；其中，所述靶蛋白为病原体来源的抗原分子或多肽；所述锚定蛋白选自金黄色葡萄球菌谷氨酰胺合成酶、金黄色葡萄球菌烯醇化酶、金黄色葡萄球菌丙酮酸脱氢酶β亚单位、金黄色葡萄球菌ABC转运胞外结合亚单位、金黄色葡萄球菌30S核糖体蛋白S3、金黄色葡萄球菌50S核糖体蛋白L5中的一个或多个。本发明的展示系统不含病毒来源的核酸，大大提高了膜泡使用的安全性。而且，金黄色葡萄球菌不含内毒素成分，简化了重组膜泡的纯化工艺，提高了制备效率。

技术领域

本发明涉及一种蛋白表面展示系统，具体提供了一种能够表达展示异源蛋白质的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)表面展示系统及其构建方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种革兰阳性球菌，2009年，韩国学者Lee等首次证实金黄色葡萄球菌可分泌细菌膜泡(Bacterial membrane vesicles，MVs)(Lee EY，et al.Proteomics 2009，9，5425-5436)。

细菌膜泡是细菌在生长过程中自然分泌到菌体细胞外的一种纳米级膜性结构，直径50～200nm不等，这种结构在分泌时可携带细菌合成的重要抗原等成分(Kulp A，etal.Annu Rev Microbiol，2010；64：163-84)，并将特定的抗原展现在MVs表面。因细菌MVs具有可表面呈现细菌来源抗原组分的特性，故采用分子生物学技术就有可能将外源基因(如其他细菌或病毒的保护性抗原基因)插入到金黄色葡萄球菌染色体中特定的抗原靶位基因中，利用细菌的膜泡分泌机制，将外来抗原展示在金黄色葡萄球菌膜泡表面，构建成展示系统。利用该展示系统可以制备检测用的抗原，亦可展示病原微生物保护性抗原，用作候选疫苗等。

最早的表面展示系统(Surface display system)是美国Parmley和Smith(Gene，1988；73：305-318)建立的以丝状噬菌体为载体的表面展示系统，用于展示多肽。该技术曾广泛用于功能性多肽的筛选(Henry KA，et al.Front Microbiol.2015：6：755)。后来，以不同载体为基础的展示系统得以不断发展。2008年，在申请号为200810051044的中国专利申请中公开了一种以细菌为载体的嗜酸乳杆菌S-层蛋白表面展示系统的构建。2011年，在申请号为201110215823的中国专利申请中公开了一种以真菌为载体的毕赤酵母壁蛋白Gcw28及其表面展示系统和构建方法，将巴斯德毕赤酵母壁蛋白Gcw28作为锚定蛋白，再通过生物技术手段，将目标靶蛋白固定在毕赤酵母细胞表面，以实现展示。然而，这些展示系统均是将目标分子直接展示在载体的表面，这些载体本身就是一种微生物，存在变异、耐药、致病等风险，使用范围受到限制。能否在利用微生物生长特性的基础上，发展出遗传稳定，无致病风险的展示系统是本发明关注的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型且安全的表面展示系统，在细菌分泌的膜泡中筛选合适的锚定分子，再将外源目标分子与特定的锚定分子进行融合，通过细菌的膜泡分泌机制，产生能展示目标分子的重组细菌膜泡(示意图见图1)，并将其用作检测抗原或者制备候选疫苗。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种金黄色葡萄球菌膜泡展示系统，所述展示系统将任选靶蛋白的编码核苷酸序列插入到锚定蛋白的编码基因的终止子前，表达的融合蛋白将所述靶蛋白展示于金黄色葡萄球菌分泌的膜泡表面；

其中，所述靶蛋白为病原体来源的抗原分子或多肽；