[发明专利]一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法

说明书

一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，其特征是利用细胞内特异表达的靶标microRNA分子作为催化剂，催化金纳米粒子‑量子点组装体的去组装反应，重复利用单个microRNA分子将多个QD与GNP进行解离，使预先被猝灭的QD荧光信号恢复并被多级放大，从而实现对活细胞内靶标microRNA分子的高灵敏度检测与成像，并以此作为区分肿瘤细胞和正常细胞的依据。

技术领域

本发明涉及分析化学、纳米材料等领域，具体涉及一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，具体包括活细胞内microRNA分子催化金纳米粒子与量子点之间的去组装反应，改变GNP与QD之间的荧光共振能量转移效应，对QD的荧光信号进行放大，从而实现对活细胞中靶标microRNA分子高特异性和高灵敏度的检测方法，并以此实现对肿瘤细胞和正常细胞的准确区分。

背景技术

量子点（quantum dots，英文简称QDs）是一种尺度小于或者近似激子波尔粒径的半导体纳米晶体。相比于传统的有机分子染料，其具有独特且优异的光学性质，比如激发谱宽且连续分布，发射波长可调，荧光量子产率高，荧光寿命长，抗光漂白性强等，因而在生物标记成像、光电子器件，光伏太阳能材料等领域具有广泛的应用前景。QDs独特的荧光性质使得其能够作为荧光共振能量转移效应的理想供体；同时由于高效的表面等离子共振效应和对可见波段光谱的强烈吸收性能，金纳米粒子（英文简称GNP）能够作为荧光共振能量转移效应的理想受体。

DNA分子是遗传信息的载体，其由于Watson-Crick碱基互补配对原则而具有可编程性；以toe-hold（中文名叫立足点，它是DNA链取代反应中需要的条件）介导的DNA链取代反应，可以实现DNA双链与单链之间有序的取代反应。以含有PS段（即磷硫键，P-S）和PO段（即磷氧键，P-O）的DNA作为模板分子来合成量子点的方法，不仅能够简单而直接地对QD表面进行DNA共价偶联修饰，还能够通过调节PS段的长度以及量子点的粒径大小来精确控制量子点表面的DNA分子的数量；同时外部的PO段仍处于自由伸展状态，保持着DNA的可编程性。同样，由于巯基（-SH）与Au原子之间强烈的共价键结合能力，修饰了-SH的DNA分子能够轻易地被修饰到GNP的表面，所修饰的DNA分子同样保持着可编程性。因此，上述方法所获得的DNA修饰的QD和GNP，可以通过DNA分子实现程序化地可控地自组装并形成具有高效荧光共振能量转移效应的GNP-QD纳米组装体。

MicroRNA是一类关键的非编码性微小RNA分子，其对于细胞中基因表达有着重要的调控作用。MicroRNA的非正常表达往往跟多种疾病，特别是肿瘤的发生发展有着密切的关联。因此对microRNA的特异性和高灵敏度的检测将具有十分重要的意义。现有的microRNA分子的检测方法，主要集中于体外检测，包括聚合酶链式反应（即PCR）和分子信标（即Molecular Beacon）的方法。体外检测首先要求将microRNA分子从细胞中提取出来。然而提取过程不仅耗时耗力，也往往会对原有的microRNA分子产生污染，如提取过程的效率问题往往导致获得的microRNA分子的浓度少于细胞中的实际值；或者因为核酸酶的影响，使得microRNA分子在提取过程中被部分降解等。因此发展一种在活细胞中直接的、特异性和高灵敏度的microRNA分子的检测方法将会具有重要的意义。

发明内容

本发明目的是提供一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，解决了目前microRNA分子的检测方法提取过程效率低、灵敏度不够高的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新型的活细胞中microRNA分子的检测方法，包括以下步骤：