[发明专利]一种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪流行性乙型脑炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis,JE)是一种由流行性乙型脑炎病毒(JEV)引起的以中枢神经系统损害为主的虫媒性人兽共患的自然疫源性传染病。JEV在温带热带地区主要以蚊子-水鸟或猪-水鸟的途径终年传播。目前，全球有30亿人口生活在乙脑流行区，其主要流行于远东及东南亚国家和地区主要亚洲，以中国、印度和东南亚地区流行较为严重。20世纪30年代，日本首个报道了JE的流行。1924年夏，日本和朝鲜爆发大规模的乙型脑炎，6000多人感染，病死率达80%左右，在1958年，越南乙型脑炎流行中，有6000多人感染。中国是乙型脑炎的流行区，近年全球报道的乙型脑炎近80%发生在我国，每年报道有2万多例，病死率10%以上，且幸存者中约有15.3%留有不同程度的后遗症。

猪是流行性乙型脑炎病毒的越冬宿主和主要扩增动物，携带病毒的猪是人乙型脑炎的最主要传染源，呈猪-蚊-人链锁传播，人类的每一次乙型脑炎大流行均与猪群中的乙型脑炎流行情况息息相关，因此乙型脑炎是亚洲公共卫生的重要问题之一，世界卫生组织(OIE)将其列为B类传染病，我国农业部将其归于二类动物疾病。因此，对猪源流行性乙型脑炎诊断方法的研究十分必要。

对乙型脑炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪流行性乙型脑炎病毒的关键。目前实验室诊断JEV的方法大致可分为2类：①血清学方法，如ELISA方法、补体结合试验（CT）、血凝抑制试验（HI）和中和试验（NT）、免疫细胞化学法等；②分子生物学方法。血清学方法存在需要对急性期和恢复期的血清都进行检测，比较费时费力，且特异性和敏感性不高等缺点，不利于对JEV的早期感染做出快速准确诊断。分子生物学方法包括PCR-ELISA微板杂交法、RT-PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片等，虽然此类方法较病毒分离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。

发明内容

本发明的目的是为了解决基层检测猪流行性乙型脑炎病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪流行性乙型脑炎病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪流行性乙型脑炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪流行性乙型脑炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）：

其中引物序列为：

F3TGGGTGGACTTGGTGCTA

B3TGGGCTTCTCCAGTCGTG

FIPTCGATGTTGATCATGCGGACGTAGACAGCTGCTTGACAATCA

BIPAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCAGCCACCGTCGAGATGTC

LFTGTTGGTTTGTCGTTTGCCA

LBGTTACTGCTATCATGCTTCAGTCA；

所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

以上所述的猪流行性乙型脑炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪流行性乙型脑炎病毒的RNA。自猪流行性乙型脑炎病变组织样品或带毒蚊子中提取的猪流行性乙型脑炎病毒的RNA。

以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL15-35mM、MgSO₄15-20mM、(NH₄)₂SO₄15-25mM、Tween200.4-0.8℅、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH为8.6条件下，将上述溶剂混合均匀获得。