[发明专利]一种校对活性酶抑制剂及其降低抑制作用的方法

说明书

本发明公开了一种校对活性酶抑制剂及降低所述校对活性酶抑制剂在聚合酶链式反应中对校对活性酶活性抑制的方法，所述抑制剂为含有连续或不完全连续的n个G的寡核苷酸，n为大于4的正整数；所述不完全连续为n个G中间含有1个A、T或C；本发明提供一种校对活性酶抑制剂，富含G碱基的寡核苷酸能够抑制具有校对活性的DNA聚合酶的活性，使PCR扩增失败；通过将降低含有所述抑制剂的寡核苷酸浓度(降低至不大于0.1μM)，或者将富含C碱基的寡核苷酸与富含G碱基的寡核苷酸互补配对后能够降低其抑制作用。

(一)技术领域

本发明涉及一种聚合酶抑制剂，特别涉及一种聚合酶链式反应中抑制具有校对活性酶的某些含特定序列的寡核苷酸及其降低抑制作用的方法。

(二)背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)自从被发明之后，迅速成为分子生物学的日常使用技术。最开始使用的耐热Taq DNA聚合酶(Taq)并不具备3’→5’外切核酸酶活性，即校对活性，扩增的产物保真度较低。随后科研人员找到了几种具有校对活性的DNA聚合酶，比如保真度最高的Pfu DNA聚合酶(Pfu)。单独使用Taq不能扩增长片段的DNA，而单独使用Pfu虽然能够减少突变率，但其只能扩增比Taq更短的DNA片段。由于Pfu的持续合成能力(Processivity)较低，即一个酶结合到模板上之后一次合成的碱基数比较少，科研人员认为提高酶的持续合成能力能够改善扩增长片段的能力。1994，Barnes提出Taq或Klentaq在复制DNA过程中容易掺入错误的碱基而使DNA链合成终止，当加入少量的Pfu时，Pfu的校对活性能去除不配对的碱基，使DNA链合成能够继续进行，这样的混合酶能够扩增任一单独酶都无法扩增的长片段DNA。Barnes的结果表明对没有校对活性的酶来说，持续合成能力并不是合成长片段的主要影响因素，因为Klentaq的持续合成能力比Taq酶更低，但Klentaq的混合酶比Taq的混合酶能扩增更长的片段；加入有校对活性的酶才是最关键的影响因素，当Klentaq与Pfu exo-(一种缺乏校对活性的Pfu突变体)混合时，则不能扩增长片段。近几年的研究表明，提高酶的持续合成能力，尤其是对具有校对活性的DNA聚合酶，也具有至关重要的作用，比如Pfu融合了Sso7d这个双链DNA结合结构域之后，酶的持续合成能力大大提高，可用于扩增长片段DNA。然而，我们在用这种基因工程改造过的具有校对活性的DNA聚合酶扩增时，仍然时不时地遇到扩增失败的问题，我们发现，其中的部分原因是这类具有校对活性的酶能够被某些含特定序列的寡核苷酸抑制。

(三)发明内容

本发明目的是寻找抑制校对活性的耐热DNA聚合酶抑制序列，并寻找消除其抑制作用的方法，提供一种聚合酶链式反应中抑制校对活性酶活性的抑制剂及降低抑制的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种校对活性酶抑制剂，所述抑制剂为含有连续或不完全连续的n个G的寡核苷酸，n为大于4的正整数，优选所述n为5～8的正整数；所述不完全连续为n个G中间含有1个A、T或C。

进一步，所述校对活性酶抑制剂为含有下列序列之一：(1)GGGGGHGG，H为A、T或C；(2)GGGGG；(3)GGGGGG；(4)GGGGSG，S为G或C；(5)GGGGHGG，H为A、T或C；(6)GGGGGHG，H为A、T或C；(7)GGGGGH，H为A、T或C。

本发明还提供一种降低所述校对活性酶抑制剂在聚合酶链式反应中对校对活性酶抑制的方法，所述方法是将聚合酶链式反应体系中含有所述抑制剂的寡核苷酸序列浓度降低至不大于0.1μM，优选0.02～0.1μM。

本发明还提供一种降低所述校对活性酶抑制剂在聚合酶链式反应中对校对活性酶抑制的方法，所述方法是向含有所述抑制剂的寡核苷酸中添加与抑制剂序列互补的寡核苷酸。