[发明专利]YBX1稳定表达的SMCC-7721细胞系及构建方法

权利要求书

1.一种稳定表达YBX1蛋白的SMCC-7721细胞系的构建方法，其特征在于，以肝癌SMCC-7721细胞作为宿主细胞，感染带有YBX1基因的慢病毒表达质粒，经Puromycin药物筛选、细胞扩大培养后获得。

2.如权利要求1所述的稳定表达YBX1蛋白的SMCC-7721细胞系的构建方法，其特征在于，其中慢病毒表达载体pGIPZ-YBX1-tGFP构建方法在于：

(1)利用人工寡核苷酸合成和聚合酶链式反应(PCR)技术，以人正常乳腺癌细胞(HMLE)cDNA为模板扩增YBX1全长基因序列；PCR引物序列为，

YBX1 Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

YBX1 Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

(2)将扩增的人YBX1全长基因克隆到T载体中，构建成T-YBX1重组载体；

(3)采用多重PCR方法，分别以T-YBX1载体为模板扩增YBX1基因，以pGIPZ载体为模板扩增CMV基因和tGFP基因，引物序列如下(括号中表示酶切位点或接头序列，下划线表示基因名称)：

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'

3'CMV：5'-GGTGGCAGATCCTCTAGTAGAG-3'

5'(CMV)-YBX1：

5'-AGAGGATCTGCCACCATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

3'YBX1-(GFP)：

5'-TCCATACCTCCAGCTCCCTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

5'tGFP：5'-GGAGCTGGAGGTATGGAGAGCGACGAGAGCG-3'

3'tGFP-(Not I)：5'-TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC-3'

(4)将上述PCR产物纯化后、混合在一起作为模板，利用下列引物扩增CMV-YBX1-tGFP融合基因；其中5'端引物带有Xba I位点，3'端引物带有Not I位点，

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'

3'tGFP-(Not I)：5'-TTTGCGGCCGCTACTTGTACATTATTC-3'

(5)将上述PCR产物克隆到pCR4-Blunt载体上，包括如下步骤：利用Xba I和Not I双酶切PCR产物，然后切胶回收；将pCR4-Blunt载体同样进行Xba I和Not I双酶切，切胶回收线性载体；将CMV-YBX1-tGFP基因连接到pCR4-Blunt线性载体上，构建pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP重组载体，送测序鉴定；

(6)将上述CMV-YBX1-tGFP基因克隆到慢病毒表达载体pGIPZ上，包括如下步骤：利用Xba I和Not I双酶切pCR4-Blunt-CMV-YBX1-tGFP载体，切胶回收CMV-YBX1-tGFP基因，利用Xba I和Not I双酶切pGIPZ载体，切胶回收线性载体；将上述获得的CMV-YBX1-tGFP基因连接到pGIPZ线性载体中，最终获得表达YBX1基因的慢病毒表达载体pGIPZ-YBX1-tGFP。