[发明专利]一种大鼠胚胎干细胞高效培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养基，尤其是涉及一种大鼠胚胎干细胞高效培养基。

背景技术

大鼠胚胎干细胞具有极其重要的科研价值。而大鼠胚胎干细胞的培养方法由 AustinSmith与应其龙等于2008年所发明。最早的大鼠胚胎干细胞培养基主要依 靠“3i”抑制剂体系：CHIR99021,PD184352和SU5402。随后，随着研究的深入， 应其龙又将“3i”大鼠胚胎干细胞培养体系优化为“2i”培养体系：CHIR99021 PD0325901。但是“2i”培养体系培养时间较长，并且不容易获得大型克隆，同时 其稳定性较差。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种效果稳定、 培养周期短、可获得大型克隆的大鼠胚胎干细胞高效培养基。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种大鼠胚胎干细胞高效培养基，每40ml的大鼠胚胎干细胞高效培养基包括 以下成分：

所述的b-巯基乙醇是以DPBS为溶剂的溶液形态，且b-巯基乙醇溶液的浓度 为55mM。

所述的CHIR99021是以DMSO为溶剂的溶液形态，且CHIR99021溶液的浓 度为10mM。

所述的PD0325901是以DMSO为溶剂的溶液形态，且PD0325901溶液的浓度 为10mM。

所述的N-2添加剂为100倍浓度储存液。

所述的B-27添加剂为无血清的50倍浓度储存液。

所述的重组小鼠白血病抑制因子为10⁷单位。

作为优选，每40ml的大鼠胚胎干细胞高效培养基还包括以下成分：青链霉素 双抗溶液0.5ml，所述的青链霉素双抗溶液含5000单位青霉素和5000ug链霉素。 青链霉素双抗溶液为防止细胞污染而加入，其本身对大鼠胚胎干细胞高效培养无显 著作用，可根据实际情况决定是否添加。

重组小鼠白血病抑制因子，即recombinantmouseLeukemiaInhibitoryFactor(简 称为mLIF，本培养基所使用重组小鼠白血病抑制因子为10⁷单位)。

培养基成分主要作用：

DMEM/F12培养基：此培养基可用来培养啮齿类动物细胞，尤其适合对大鼠 和兔子细胞的培养，并被证明在骨髓瘤与杂交瘤细胞培养中可以使细胞处于高质量 状态。

N-2添加剂：主要用于成神经细胞瘤以及周围神经系统(PNS)与中枢神经系统 (CNS)的原代细胞培养。N-2添加剂可以替代Bottenstein中的N1添加剂，用于添 加了生长因子bFGF和EGF的Neurobasal培养基或DMEM培养基。

Neurobasal培养基：用于培养出生前和胎儿神经元细胞。使用时需添加B-27添 加剂。此培养基可用于海马神经元，大脑皮层和大脑其他区域的神经细胞的生长。 此外，该培养基可以在不添加胶质细胞饲养层的情况下维持神经细胞的同源群落存 活。

B-27添加剂：是无血清添加剂，用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS) 神经元的生长。该培养基可以与Neurobasal培养基组合使用，在神经细胞培养时 省略了饲养层细胞。

L-谷氨酰胺：主要用于细胞培养，可以作为原料合成嘌呤、嘧啶核苷酸，氨基 糖，谷胱甘肽以及谷氨酸，对于细胞生长非常重要。

b-巯基乙醇：可以促使胚胎干细胞分裂，提高获取囊胚的质量。

CHIR99021：CHIR99021可以抑制GSK-3，使胞内游离β-catenin增加，激活 经典Wnt信号通路。

PD0325901：是非ATP竞争性的MAPK激酶MEK抑制剂。苏氨酸/酪氨酸激 酶MEK是RAS/RAF/MEK/ERK信号通路的关键组成部分，在胚胎干细胞增殖分 化过程中具有重要作用。PD0325901可精确有效地抑制MEK。

重组小鼠白血病抑制因子：可以维持胚胎干细胞干性状态。

在配制培养基时首先将20mlDMEM/F12培养基与0.2mlN-2添加剂(100倍浓 度储存液)配成混合液1。