[发明专利]衍生化HPLC‑DAD法测定药物中小分子卤代羧酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于药品分析检测领域，涉及衍生化HPLC-DAD法测定小分子卤代羧酸的方法，尤其涉及衍生化HPLC-DAD法测定药物中小分子卤代羧酸的方法。

背景技术

小分子卤代羧酸(Halogenated carboxylic acids,HCAs)，作为水环境中主要的消毒副产物，由于具有潜在的基因毒性和致癌性^[1,2]，很早就受到了许多环境监管部门包括美国环境保护局(USEPA)^[3]、世界卫生组织(WHO)^[4]等的普遍关注，并被列为水质研究的常规监测指标之一。在医药工业中，这类化合物因具有较高的反应活性以及特殊的生理活性(由卤元素引入)^[5]，经常被用作有机合成中活泼的酰化剂或烷化剂，在农药、医药等领域有着广泛应用^[6-13]，例如，氯乙酸可用于合成维生素B₆、他达拉非、肾上腺素等的中间体；2-氯丙酸常用作布洛芬绿色生产工艺的起始原料；溴乙酸和溴丙酸类常用于除草剂、杀虫剂等农药的制备。除了工业生产外，药物储藏过程中受外界条件影响也会产生卤代羧酸，比如氯霉素降解生成二氯乙酸^[14]。因此这类化合物往往容易在药品中残留，过量摄入可能对人体造成危害。目前国际上普遍采用毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern,TTC)来对基因毒性杂质进行限度控制^[15-17]。基因毒性杂质的限度通常较低，因此需要建立高灵敏的分析方法对药品中的这类化合物进行监控。

现今，大多数文献报道的方法都是针对于测定水环境中的卤乙酸(Haloacetic acids,HAAs)。美国环保局(USEPA)将气相色谱串联电子捕获检测器(GC-ECD)列为检测水环境中卤乙酸的标准方法^[18-21]，该方法需要将待测物衍生化成可挥发性的酯类，然后液液萃取富集，方能进行分析。离子色谱法(IC)^[22,23]和反相高效液相色谱法(RP-LC)^[24,25]等液相色谱方法，结合电化学检测器(ECD)或紫外检测器(UV,210nm)被报道用于分析水样中的卤乙酸。这些方法往往需要繁琐的柱前浓缩和清洁操作才能获得足够的专属性和灵敏度。质谱法(MS)，包括亲水作用色谱串联质谱(HILIC-MS)^[26]、GC-MS^[27,28]、LC-MS^[29,30]和IC-MS^[31,32]等也被广泛用于测定饮用水中的卤乙酸的含量。虽然质谱检测器是一种灵敏和通用的检测器，然而高昂的价格限制了它的推广使用。

相比于水样分析，测定药物中残留的小分子卤代羧酸面临着更多的挑战^[14,16,33]。首先药品基质的复杂性远高于水样，尤其含有大量与小分子卤代羧酸性质相似的有机小分子，因此要求分析方法具备高度的专属性^[16,33]，这样才能有效减少干扰；另一个问题是药物本身在操作过程中容易受到外界因素影响降解生成新的小分子卤代羧酸^[14]影响测定的结果，为此前处理条件越简单、温和对结果的准确性越有利。考虑到上述事实，我们希望通过液相衍生化技术来改善这些问题。液相衍生化技术通过化学反应给待测物引入特定的基团，不仅可以提高检测灵敏度，还能改善待测物的分离效果，特别适合于小分子极性物质的定性定量分析^[34]。Simone Jr等^[35]采用柱后荧光衍生化对饮用水中的卤乙酸进行测定，以烟酰胺为其衍生化试剂，通过实验室自制的自动化仪器装置以实现衍生化。然而特定的装置不仅增加了实验成本，而且难以推广用于常规药物分析。Ghassempour等人^[36]建立了柱前衍生化-HPLC法对甜菜碱样品氯乙酸和二氯乙酸进行测定。此方法使用1-萘胺作为衍生化试剂，90℃下反应30min，随后220nm波长下检测。这方法的主要缺陷是：一方面，高温容易产生降解杂质^[37]；另一方面，低波长下检测基线噪音大，干扰严重^[38]。