[发明专利]一种药物成分提取方法

权利要求书

1.一种药物成分提取方法，其特征在于：包括体外合成修饰mRNA的方法和纳米颗粒包被mRNA的方法，所述体外合成修饰mRNA的方法包括以下步骤：

(1)查得Pdx1(852bp)、NeuroD(1070bp)、Mafa(1062bp)三个转录因子的CDS序列，设计引物PCR扩增得到的含BamHI、XhoI酶切位点的Pdx1、Ngn3、Mafa三种转录因子的CDS序列，并将其克隆至mRNA载体，得到Pdx1、Ngn3、Mafa体外合成mRNA的模板；

(2)通过对体外合成mRNA的帽子结构、Ploy(A)尾巴长短及碱基类似物替代等方面的修饰可大大增加mRNA的稳定性；

(3)在体外合成mRNA时以ARCA代替了普通的帽子结构，添加120个A的Ploy(A)尾巴，用假尿苷代替尿苷，5-甲基胞苷代替胞苷；

所述纳米颗粒包被mRNA的方法包括以下步骤：

(A)体外合成的三种胰腺转录因子mRNA与1mg/ml的硫酸鱼精蛋白室温旋转摇床上摇30min；

(B)水相用100mg聚乙烯醇PVA溶于5ml水中室温搅拌2h使之完全溶解，将合成的mRNA和鱼精蛋白的复合物加入完全溶解的水相中，有机相用100mg聚已内酯PCL溶于10ml有机相中湿热30℃、1h；

(C)用0.22μm的过滤器过滤除去未溶解的固体，将过滤的有机相加入上述水相中，边加边搅拌，最终的乳液在磁力搅拌器上以1000rpm速度搅拌1h，然后超声30min，为除去有机溶剂，增加纳米颗粒的硬度，将其放入旋转蒸发仪中，参数设置为50mba、40℃、20min；

(D)最后得到的包被mRNA的纳米颗粒用RNase-freewater洗3遍，12000rpm离心10min,加水重悬保存在4℃。