[发明专利]一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法

权利要求书

1.一种显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，步骤如下：

一、染色体制备

选取黄姑鱼，采用三针法注射；前两针按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.6-1.0ml党参煎汁液和BSA的混合液，注射第一针15h后注射第二针；第三针是在取样前2.5h按每100g鱼重在胸鳍基部注射0.08-0.12ml秋水仙素；剖取黄姑鱼的头肾，用KCl溶液低渗，再用固定液固定，制得细胞悬液，-40℃保存；取细胞悬液，滴在干净玻片上，60℃老化2.5-3.5h，制得老化的玻片；所述党参煎汁液和BSA的混合液是将50g党参煎熬至最终体积为50ml，再加入0.405g NaCl和125mg的BSA混匀后制得；

二、提取黄姑鱼鳍条DNA

用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取黄姑鱼鳍条DNA；

三、制备FISH探针

用切口平移方法标记黄姑鱼鳍条DNA，制得的FISH探针长度在200-750bp之间；

四、基因组荧光原位杂交

1）玻片变性：将老化的玻片在现配的74℃的体积浓度为80%的甲酰胺中变性2.5min，再依次用质量浓度为70%、80%、90%、100%、100%的乙醇分别脱水，制得已变性的玻片；

2）FISH探针变性：将制备好的FISH探针加入到杂交缓冲液HB中，使得终浓度为1.5-2ng/μl，72℃变性8min，然后立即放置冰块上，制得变性的FISH探针；所述杂交缓冲液HB含有杂交基础缓冲液、去离子甲酰胺与50%硫酸葡聚糖；

3）杂交：将变性的FISH探针加入到已变性的玻片上，用封口膜封上，于37℃恒温箱中杂交12-16h；

4）放大：杂交后取出，室温放置0.8-1.2h后，依次使用体积浓度为10%的甲酰胺溶液、4×SSC、4×SSC各洗涤5min，室温晾干后加AV到玻片上有FISH探针的地方37℃孵育；其中，AV为4μg/ml的Avidin-Alexa fluor-488标记的兔抗亲和素；

5）洗涤：孵育后取出，依次用2×T-SSC、4×SSC、4×SSC暗处洗涤；

6）信号检测：室温晾干后用碘化丙啶PI进行复染，指甲油封片，然后用荧光显微镜完成显微观察与拍照；通过绿色荧光滤片组观察红色荧光信号，通过蓝色荧光滤片组观察绿色荧光信号，利用显微镜相连的电荷藕合器件图像传感器拍摄图像，利用cellSens软件分别采用黑白模式采集图像，再组合通道形成彩色图像。

2.根据权利要求1所述的显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，KCl溶液的浓度为0.075mol/l。

3.根据权利要求1所述的显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，步骤一中固定液采用卡诺氏固定液。

4.根据权利要求1所述的显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，步骤四中体积浓度为80%的甲酰胺包含12ml甲酰胺、1.5ml 20×SSC与1.5ml灭菌水。

5.根据权利要求1所述的显示黄姑鱼染色体形态特征的方法，其特征在于，步骤四中碘化丙啶PI的终浓度为1μg/ml。