[发明专利]利用cDNA-AFLP体系挖掘荻耐盐基因的方法

权利要求书

1.适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建方法，其特征在于取不 同耐盐荻资源根系、叶片，以提取的总RNA为模板合成cDNA双链并纯化，利用EcoRⅠ及MseⅠ限 制性内切酶对获得的双链cDNA进行限制性酶切并连接接头，然后进行预扩增和选择性扩 增，利用变性聚丙烯酰胺凝胶对反应产物进行电泳、银染后分析扩增产物多态性及不同耐 性材料的差异条带，并通过对差异条带的回收、克隆、测序分析，挖掘能源作物——荻的耐 盐基因。

2.根据权利要求1所述的适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建 方法，其特征在于所述的EcoRⅠ限制性内切酶的识别序列为6bp，所述的MseⅠ限制性内切酶 的识别序列分别为4bp。

3.根据权利要求1所述的适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建 方法，其特征在于所述的EcoRⅠ限制性内切酶的接头序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2， MseⅠ限制性内切酶接头序列为SEQIDNo.3和SEQIDNo.4。

4.根据权利要求1所述的适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建 方法，其特征在于所述的EcoRⅠ限制性内切酶接头序列互补的预扩增引物序列为E00：SEQ IDNo.5，MseⅠ限制性内切酶接头序列互补的预扩增引物序列为M00：SEQIDNo.6。

5.根据权利要求1所述的适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建 方法，其特征在于所述的选择性扩增引物为EcoRⅠ限制性内切酶选择性引物一条，MseⅠ限制 性内切酶选择性引物一条；EcoRⅠ限制性内切酶选择性引物选自E-AAC：SEQIDNo.7，E- AAG：SEQIDNo.8，E-ACA：SEQIDNo.9，E-ACT：SEQIDNo.10，E-ACC：SEQIDNo.11，E- ACG：SEQIDNo.12，E-AGC：SEQIDNo.13，E-AGG：SEQIDNo.14中的任意一条；所述的MseⅠ 限制性内切酶选择性引物选自M-CAA：SEQIDNo.15，M-CAC：SEQIDNo.16，M-CAG：SEQID No.17，M-CAT：SEQIDNo.18，M-CTA：SEQIDNo.19，M-CTC：SEQIDNo.20，M-CTG：SEQID No.21，M-CTT：SEQIDNo.22中的任意一条。

6.根据权利要求1所述的适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建 方法，其特征在于所述的选择性扩增的反应体系及程序如下：ddH2O3.425μl，Buffer1μl， dNTPs（10Mm/l）1.5μl，E-NNN（50ng/μl，具体为SEQIDNo.7-14中的一条）0.5μl，M--NNN （50ng/μl，具体为SEQIDNo.15-22中的一条）0.5μl，Tag聚合酶（5u/μl）0.125μl，预扩增稀 释后模板2.5μl，MgCl2（25mM/L）0.45μl，反应总体积10μl，混匀，稍离心，进行PCR扩增反应， 扩增程序为94℃2min；94℃30s，65℃（每循环降低0.7℃）30s，72℃60s，共12个循环；94℃ 30s，56℃30s，72℃1min共23个循环；72℃10min，反应结束后产物利于聚丙烯凝胶电泳与银 染分析。

7.根据权利要求1所述的适用于能源作物——荻耐盐基因挖掘的cDNA-AFLP体系构建 方法，其特征在于所述的挖掘荻耐盐差异表达基因的方法还包括差异片段的回收及二次扩 增，并进一步进行克隆及测序比对分析。