[发明专利]一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针及其合成方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的及其合成和应用。该探针通过4‑氨基‑1,8‑萘酐与氯乙酰氯、二乙胺、4‑氨甲基苯磺酰胺等反应得到，其合成方法操作简单、原料低廉。该探针在水溶液中呈现出～470nm的蓝色荧光，而在甲醇，二甲基亚砜，N,N‑二甲基甲酰胺、乙醇等极性溶剂中呈现出525‑560nm的绿色到黄色荧光。在20mM的磷酸缓冲液中，当逐渐加入0‑0.7当量人碳酸酐酶1后，～470nm的荧光峰逐渐降低而～530nm处荧光峰逐渐增强。因而，该探针能够比率识别人碳酸酐酶，从而排除设备、样品等外界因素影响。

技术领域

本发明涉及一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成及应用。

背景技术

随着生命科学研究的迅速发展，荧光分析技术在分子生物学、细胞免疫学、肿瘤学、医学等方面的应用越发广泛。而有机小分子荧光探针以其体积小、易于合成、多样性等优势逐渐成为荧光分析技术的一种重要手段。在荧光方法测定中，荧光探针在与反应物结合后，出现激发光或发射光谱波长移动的探针，可使用在两个不同波长测定的荧光强度比率进行测定，这类荧光探针被称为比率型探针。其相对单纯荧光增强型探针相比，能够消除外界环境影响得到更准确数据。然而应用于蛋白的识别的比率型探针极少有报道，且需求更为迫切。

碳酸酐酶普遍存在于哺乳动物中的几乎所有的组织中，它是一类含锌金属酶,能可逆性地催化CO₂的水合反应,产生参与人体多种生理功能的HCO₃^-及H⁺。现在发现至少有16种碳酸酐酶亚型。根据碳酸酐酶氨基酸序列的不同,碳酸酐酶可分为α、β、γ、δ、ε五种不同类型的酶。其中α-CAs存在于脊椎动物、细菌、藻类及绿色植物的胞浆中；β-CAs存在于高等植物及藻类叶绿体中,对植物光合作用过程中CO₂的获取及CO₂浓度的维持有着必不可少的作用；γ-CAs则主要存在于太古细菌及一些细菌中；δ-CAs主要存在于海洋硅藻中。而人碳酸酸酐酶I是其中一员，其在人生命过程中(如：骨的形成等)起着重要作用。

磺酰胺类衍生物在70多年前已经被发现对碳酸酐酶有较强的抑制效果。磺酰胺(-SO₂NH₂)基团中的N与酶活性中心的Zn²⁺相连接,取代与Zn²⁺相连的水分子与Thr-199的OH^-形成氢键。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针，该探针能够与人碳酸酐酶1特异性结合并进行比率的识别。

本发明的另一目的是提供一类用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成方法，该方法具有原料低廉、操作简便等优点。

本发明提供一种用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针，以1,8-萘酰亚胺为荧光报告基团，2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基为荧光响应位点，苯磺酰胺为靶向位点，该荧光探针具有如下结构：

该荧光探针能够特异性与人碳酸酐酶1结合使其波长在～470nm的荧光峰逐渐降低而波长在～530nm处荧光峰逐渐增强，从而达到比率识别碳酸酐酶的目的。

一类用于比率识别人碳酸酐酶的小分子荧光探针的合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下缓慢加入氯乙酰氯。室温下搅拌过夜(10-16h)，减压除去溶剂，硅胶柱分离得米白色固体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐。