[发明专利]一种三维结构的细胞捕获与释放芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微流控芯片的制备方法，具体的是一种三维结构的细胞捕获与释放芯片，及采用该芯片来捕获和释放细胞的方法，适用于微米尺度的细胞和颗粒的捕获和释放。

背景技术

微流芯片是微分析系统的核心，微流芯片的发明及应用给化学、食品、环境、医学等科学领域提供了很大的便利，促使了一些分析的微型化、集成化、自动化及便捷化。大大的节省了一些化学反应对贵重化学试剂的消耗,也大大的提高了分析效率、降低了费用。

通常捕获细胞的微流芯片主要是运用机械分离法、电诱导分离法和磁操控分离法。目前运用机械分离法制作的微流芯片，捕获效率达97%，但是也具有本身的一些缺点，其缺点可以概括为制作工艺复杂，孔道容易堵塞，不能满足大批量的检测需求。

目前制备的微流芯片主要采用光刻和化学刻蚀。主要使用的材料有石英、玻璃和高聚物等，使用高聚物制作的微流芯片多采用光刻制备的方法，刻蚀出来的微流芯片沟道形状规则，且光刻的工艺复杂成本高，不宜推广应用。在玻璃及石英等硅基介质制作出来的微流芯片主要采用化学刻蚀的方法来制备，其制作出来的微流芯片稳定性好，使用寿命长。但是传统的化学刻蚀的方法刻蚀出来的微流芯片的沟道都很规则，无法刻蚀出具有特殊形状的微流沟道的微流芯片。传统的刻蚀方法不能够刻蚀出特殊形状沟道的微流芯片。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种三维结构的细胞捕获及释放芯片及其制备方法，其特点包括加工简单，不堵塞，效率高，适合大批量生产与检测芯片，具有良好的化学稳定性。另一个目的在于提供一种基于三维结构的芯片进行捕获及释放细胞的方法，捕获效率高，释放出的细胞完整度好。

为了实现上述目的，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：

一种三维结构的细胞捕获及释放芯片，包括上部盖片和下部基片，上层盖片的背面刻蚀有微流沟道，盖片的微流沟道两端分别设置入口和出口，基片上有一层壳聚糖薄膜，盖片和基片通过粘合剂粘合。

上述三维结构的细胞捕获及释放芯片制备方法，其步骤如下：

（1）芯片的制备：

（a）基底的选择及清洗：选取盖片和基片的材料可以是硅片、石英或玻璃等硬质材料且至少有一个材料是透明的，将选择好的盖片和基片进行清洗，去除表面的油污等杂质；

（b）刻蚀掩膜处理：对清洗好的盖片和基片在50℃~100℃的烘箱中进行烘干处理，烘干处理之后在盖片的上下表面粘附耐化学腐蚀性的掩膜，通过激光切割，把即将要刻蚀的区域部分切出来，除去切割出来的防腐蚀掩膜，得到要刻蚀的区域；

掩膜处理的目的在于裸露出需要进行刻蚀的基片的一部分，把不需要进行刻蚀的基片的其他部分保护起来。

（c）湿法刻蚀：将处理好的盖片，通过夹具按照0.01mm/min-1mm/min的速率垂直缓慢的放入到刻蚀液中进行刻蚀，因为进入刻蚀液有先后顺序,所以导致刻蚀的时间不相同，导致了刻蚀的深度不同，从而盖片上刻蚀出的微流沟道为锲形的三维结构；

（d）打孔：去除掉盖片表面的刻蚀掩膜，使整个盖片完整的裸露出来，盖片进行清洗处理之后对盖片进行打孔，在盖片的至少两个不同等高面的区域打孔，两个孔分别为入口孔和出口孔；

（e）壳聚糖薄膜的制备：使用脱乙酰度60%-95%的壳聚糖，使0.3g-2.0g壳聚糖融入体积为10ml的0.1mol/L醋酸溶液中，经过1.5-2.5h的搅拌形成壳聚糖胶体；使用移液枪吸取1ml-5ml壳聚糖凝胶溶液滴至基片上，将基片放置在匀胶机上，转速依次为800r/min和1500r/min，各转15s，均匀铺设后静置，直至胶体成膜；

（f）盖片与基片的组合：基片和盖片贴合后，在它们的边沿涂上PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷胶)，等待10-20min后放入马弗炉进行加热，加热温度范围为200-450℃，便得到了基于三维结构的细胞捕获及释放芯片。

一种基于三维结构的芯片进行捕获及释放细胞的方法，其步骤如下：

（1）细胞的捕获：

（a）将待检测含有细胞的液体样本通过注射泵以0.01ul/min-1ul/min的速率从入口孔注入到键合完全的芯片中；

（b）继续在入口注入磷酸盐缓冲溶液（即PBS溶液），以50-100ul/min的速度注入进行清洗；

（c）在入口注入示踪物质（如：染细胞核的荧光染料如DAPI或者Hoechst染料）或加入免疫试剂，对目标细胞进行识别；