[发明专利]一种从脐带华通氏胶组织中分离提取hUC-MSC的方法

权利要求书

1.一种分离提取hUC-MSC的方法，其特征在于，所述方法包括：采用红细胞裂解液与胶 原酶处理脐带华通氏胶组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液为包含NH₄Cl和Na₂-EDTA 的水溶液，优选为包含1-20g/L的NH₄Cl和0.05-0.2mMNa₂-EDTA的水溶液，更优选为包含5- 10g/L的NH₄Cl和0.1mMNa₂-EDTA的水溶液，pH为7.2-7.4；

优选地，所述胶原酶为IV型胶原酶，优选为包含IV型胶原酶的消化液，优选为包含IV型 胶原酶、透明质酸酶、DNA酶和血清替代物的D-Hank’s液，更优选为包含1％IV型胶原酶、 0.5％透明质酸酶、300U/mlDNA酶和2％血清替代物的D-Hank’s液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将获得的脐带华通氏胶 组织分割成组织块，加入1-3倍组织块体积的所述红细胞裂解液，室温下处理2-5分钟；然后 向经处理的组织块中加入所述包含IV型胶原酶的消化液再次处理。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：经胶原酶消 化后，采用间充质干细胞无血清培养基培养，以获得原代间充质干细胞；其中所述间充质干 细胞无血清培养基包含a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生 长因子(b-FGF)和血清替代物；

优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体 积份的非必需氨基酸水溶液、8-12体积份的血清替代物、85-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和 终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含浓 度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；

更优选地，所述间充质干细胞无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的 非必需氨基酸水溶液、10体积份的血清替代物、89体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为 10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子；

最优选地，所述间充质干细胞无血清培养基由所述a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必 需氨基酸水溶液、重组人碱性成纤维生长因子和血清替代物组成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将获得的脐带 华通氏胶组织剪成1-3mm³大小的组织块，加入1.5-2倍组织块体积的红细胞裂解液，室温下 处理2-5分钟；然后向经处理的组织块中加入2-3倍体积的所述包含IV型胶原酶的消化液， 在37℃和5％浓度的CO₂下消化8-12小时；

优选地，所述方法还包括：以1-5×10⁴细胞/cm²培养皿面积的密度将得到的细胞接种于 间充质干细胞无血清培养基中，在37℃和5％浓度的CO₂下培养，每3-4天更换新鲜培养基。