[发明专利]一种快速检测色素苏丹红的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测色素苏丹红的方法，本发明还涉及一种包被蛋白G的苏丹红的ELISA检测试剂盒。

背景技术

苏丹红是一种人工合成的偶氮类、油溶性的化工染色剂，被大量地用在生物、化学等领域。

苏丹红为亲脂性偶氮化合物，外观呈暗红色或深黄色片状晶体，难溶于水，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等4种类型。其中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均为I的化学衍生物。由于国际癌症研究机构(IARC)将苏丹红归为第3类可致癌物质，研究快速检测苏丹红的方法，很有必要。

目前，对苏丹红的检测一般采用高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法及液谱-质谱联用法等，但上述方法操作复杂，价格较高。

简单快速有效的检测方法是治理苏丹红滥用问题的关键。酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有高效、灵敏、便于基层推广等优点，而且可以直接采样进行检测，与HPLC、GC-MS检测有较高的一致性，目前已有应用于苏丹红快速检测的报道，但常规的苏丹红ELISA快速检测试剂盒方法具有以下缺点：需要较高纯度的抗体，且抗体利用率低、同一板之内孔间变异较大。

一是抗体利用率低。现有技术方法是抗体直接与酶标板反应，由于抗体排列不规则，不能够保证与抗原有效相结合(见图1)。而且因为抗体利用率低，用量大，还需要较高纯度，造成检测成本较高；

二是，同一酶标板中的各孔间变异较大，影响检测结果的准确性。如图1所示。此外，现有ELISA检测方法是先包被抗原，然后加抗体，再加酶标二抗，然后再加显色剂。步骤较多，操作比较繁琐。

因此，如果能使得抗体Y排列较为整齐，保证抗体Y与抗原有效相结合，将能有效利用抗体。既提高抗体利用率，降低检测成本，又能提高检测结果的准确性。

蛋白G(ProteinG)是从链球菌A、C和G群很多菌株的细胞壁及培养上清中提取的能与IgGFc片段特异性结合的蛋白。利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，并且具有很高的亲和力。通过克隆了蛋白G的基因序列，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到酶标板上后，再进行抗体包被。将基因重组的蛋白G偶联到酶标板上后，降低了空间位阻，增加了重组蛋白G与苏丹红抗体IgG的结合能力，从而使抗体的Fab端朝向外侧，空间位阻不对抗原结合区域构成干扰，对酶标板先经蛋白G处理后，再进行抗体包被，不仅可提高同一板内及不同板间的酶标孔的均一性，而且能提高抗体的利用率。试验表明，在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的ELISA试剂盒苏丹红抗体的需用量仅为通常制备方法下抗体的需用量的十分之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测色素苏丹红的方法。具体目的是提供一种提高抗体利用率，降低检测成本，又能提高检测结果准确性的ELISA检测方法和试剂盒。

本发明利用了蛋白G的功能。检测时，在酶标孔中先加蛋白G，蛋白G具有跟抗体上Fc部分特异结合的特点，所以将蛋白G偶联到酶标板上后，使抗体的Fab端朝向外侧，从而降低了空间位阻，不对抗原结合区域构成干扰，使抗体Y排列更加的整齐，增加了重组蛋白G与苏丹红抗体IgG的结合能力，能够保证Y有效的跟抗原相结合，提高抗体的利用率(见图2)。试验表明，在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的ELISA试剂盒苏丹红抗体的需用量仅为通常制备方法下抗体的需用量的十分之一。

不仅如此，对酶标板先经蛋白G处理再进行抗体包被，还可提高同一酶标板内或不同酶标板中各孔间的均一性，提高检测的准确性。

所述蛋白G(ProteinG)是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，从链球菌A、C和G群很多菌株的细胞壁及培养上清中提取得到。蛋白G能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，并且具有很高的亲和力。

在实际应用中，所用的蛋白G也可以选用基因重组蛋白G，通过克隆蛋白G的基因序列，在大肠杆菌中表达出与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G而获得。蛋白G可以通过市售方式，方便获得。

本发明的实施例1比较了传统的方法和采用本专利的方法检测苏丹红Ⅰ，由试验结果可以看出可以只用原来的抗体浓度的十分之一，即可达到传统方法的检测效果；

实施例1是采用和未采用蛋白G处理的试验比较，其中：

实验1采用蛋白G处理，抗体用量为100微升，抗体浓度为1：1000000；

实验2未采用蛋白G处理，抗体浓度稀释比为1：100000，为实验1的10倍。抗体用量未变，仍为100微升，