[发明专利]一组用于表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测的特异性引物和探针

说明书

本发明提供一组用于表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为1）‑3）中的一种：1）、上游引物：5'‑ TCGGATCTCCATCAACT ‑3'，下游引物：5'‑ TCAAACAACGCAACCAG ‑3'，探针：5'‑ TTTTGTCACATCATCCACTGG ‑3'；所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；2）、与1）所述序列互补的序列。本发明所提供的引物和探针可对临床感染的表皮葡萄球菌含量进行定性、定量分析。

技术领域

本发明属于微生物检测方法技术领域，具体涉及一组用于表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测的特异性引物和探针。

背景技术

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）SE在自然界中分布广泛，是一种重要的机会致病菌，是血浆凝固酶阴性的葡萄糖球菌。SE引起的医院感染是多部位的，其致病性随细菌侵入途径、菌量、毒力及机体免疫力不同而异，尤其是SE引起的败血症，易被原发病所掩盖，一旦发现病已危重，预后差。此外，SE引起的临床感染好发于血液病的颗粒细胞缺乏症及实体恶性肿瘤的病人，主要是由于大量使用免疫抑制剂和广谱抗生素，还与严重原发病长期住院过程中易发生的呼吸道、手续伤口、气管切开、留置导尿及静脉导管等感染有关。SE对多种抗菌素具有耐药性，造成临床治疗的困难。近年来随着抗生素的广泛应用，医疗技术的进步，该菌从各种临床样本的分离率日益升高，甚至超过金黄色葡萄球菌而居革兰氏阳性菌之首位，成为了医院感染的重要致病菌。

SE感染的诊断至今仍是一个难题。由于SE广泛存在，为常见的细菌培养的污染菌，目前主要依靠不同部位感染的临床表现和在血液、脑脊液、尿、分泌物的涂片及培养中找到的病原菌作为诊断依据。此方法需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流程，耗时一周左右，不利于快速、准确的对表皮葡萄球菌进行检测。用免疫酶试验、免疫扩散法、乳胶凝集试验和免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等方法检测SE的结果尚不理想。近年来发展起来的实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，避免了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题，它相对于常规PCR技术先进、操作简便，实现了实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点。

发明内容

本发明的目的在于设计一组表皮葡萄球菌特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于表皮葡萄球菌检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定性或定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将表皮葡萄球菌聚集相关蛋白（Accumulation associatedprotein）基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有Aap基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据表皮葡萄球菌Aap的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明的第一个目的是提供一组用于表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）-（3）中的一种：

（1）、上游引物：5'- TCGGATCTCCATCAACT -3'

下游引物：5'- TCAAACAACGCAACCAG -3'

探针：5'- TTTTGTCACATCATCCACTGG -3'

所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列参见序列表中SEQ ID No.2；

（2）、与（1）所述序列互补的序列。

经实验验证，将（1）中所述序列向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的引物序列也能很好的扩增上述目标核苷酸序列。