[发明专利]盐肤木无花色素还原酶及其编码基因及编码基因验证方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种盐肤木无花色素还原酶及其编码基因及该编码基因的验证方法。

背景技术

五倍子是一种重要的化工原料，是由半翅目Hemiptera，蚜总科Aphidoidea,瘿绵科Pemphigidae，倍蚜族Melaphidini的五倍子蚜虫生活在漆树科Anacardiaceae盐肤木属Rhus的寄主植物上，刺激叶片组织增生而形成的虫瘿。中国五倍子利用有2000多年的历史，古代主要用于中药，现代广泛用于化工、医药、纺织、食品等行业，具有重要的经济价值。盐肤木Rhuschinensis是角倍蚜Schlechtendaliachinensis的主要寄主，角倍是角倍蚜在盐肤木上形成虫瘿，是我国主要的五倍子种类之一，其产量占我国五倍子总产量的70%以上。

角倍的主要活性成分是单宁，单宁（tannins）又称单宁酸、鞣质，是植物体内一大类多酚类黄酮化合物，单宁的生物合成途径已基本明确,主要是通过莽草酸途径合成,即由莽草酸途径形成苯丙氨酸，再经一系列反应后最终形成单宁。许多植物中类黄酮生物合成途径中关键酶基因的生化功能已经得到验证，关键酶包括无花色素还原酶（LAR），花色素还原酶（ANR），二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）、查儿酮合成酶（CHS）和查儿酮异构酶（CHI）等。无花色素还原酶（LAR）在角倍的单宁和成过程中起到重要的调节作用，所以，盐肤木无花色素还原酶（LAR）的表达水平决定了其产生的角倍的单宁含量，无花色素还原酶（LAR）基因是控制植物无花色素还原酶（LAR）表达的遗传基础。只有找到盐肤木无花色素还原酶（LAR）的基因，才能对盐肤木进行遗传改良，从而提高角倍中单宁含量。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过对盐肤木进行接种，并定期收集不同发育阶段的虫瘿分别提取RNA，通过进行转录组测序分析、基因注释、KEGG数据库比对等步骤，得到了盐肤木单宁合成关键基因RchLAR，并采用qPCR技术对RchLAR基因进行验证，具体技术方案如下：

1、样本收集与处理

将五倍子蚜虫盐肤木上（RhuschinensisMill），定期收集生长于盐肤木叶翅上不同生长时期的角倍，每次收集的角倍清除角倍内所有蚜虫后分为两部分保存，一部分冷冻保存，用于提取总RNA，另一部分用于测定单宁含量。

2、测序及转录组分析

提取去除蚜虫后的五倍子的总RNA，检测RNA质量及纯度后进行RNA转录组测序，序列经阅读质量分析、统计学比对分析、测序饱和度分析、参考基因读取分布及参考基因组读取分布分析后得到高质量盐肤木转录组基因组序列。

3、基因注释与筛选

拼接得到的所有功能基因都分别注释到NCBI数据库中的Nr数据库、Nt数据库及Swiss-Prot数据库、KEGG数据库、COG数据库、GO数据库中，得到与盐肤木单宁合成通路相关基因，并结合基因表达量与单宁含量同步一致性，最终筛选出盐肤木单宁合成的关键基因RchLAR。

4、基因功能验证

为了验证RchLAR基因，做实时荧光定量（qPCR）分析，采用相对定量方法分析RchLAR基因相对表达量。

附图说明

图1为盐肤木Rhuschinensis5个不同发育时期单宁含量；

图2为盐肤木不同发育时期单宁含量动态变化图，图中纵坐标为单宁含量（单宁占盐肤木倍子重量的百分数），横坐标为盐肤木发育的5个不同时间点（从6月21-8月28日），5个时间点盐肤木分别进行RNA转录组测序分析；

图3为盐肤木RchLAR基因qPCR相对定量结果；

图4为盐肤木RchLAR基因qPCR相对表达量验证结果，图中纵坐标RchLAR基因qPCR相对表达量，横坐标为盐肤木发育的5个不同时间点（从6月21-8月28日）。

具体实施方式

1、样本收集

五倍子蚜虫饲养于中国西南生态研究中心资源昆虫研究所中的盐肤木上（RhuschinensisMill）。每隔十五天收集一次生长于盐肤木叶翅上不同生长时期的角倍，共计8次。每次收集的角倍清除角倍内所有蚜虫后分为两部分保存，一部分先以液氮冻存，随后移入?80°C冰箱中以便提取总RNA，另一部分用于单宁含量的测定。

2、测序及转录组分析