[发明专利]AIV H7N9亚型双重微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及试剂盒检测技术领域，具体的说涉及一种检测禽流感病毒H7N9亚型的双重微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒H7N9亚型(AIVH7N9)是一种甲型流感病毒，是禽流感病毒的一个亚型。2013年H7N9禽流感感染人病例出来以来，中国杭州疾控中心和WHO中国流感中心共采集、分析了4个新H7N9甲型禽流感的基因组，并在GISAID数据库上公布。利用这4个基因组以及1193个已知的流感各亚型的基因组，分析全面的系统生成树和进化历程。结果表明，在新H7N9亚型型禽流感的8个基因中，表面血凝素(Haemagglutinin，H)蛋白基因来自于H7亚型病毒，神经氨酸酶(Neuraminidase，N)基因来自韩国野鸟中分离的禽流感病毒H11N9，其余6个内核基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)都来自H9N2，表明新H7N9甲型禽流感是一个变异种，是由H7、H11N9、H9N2这三个病毒的基因重组产生的一个全新的基因。

为了对禽流感疫情在早期就能够有效控制，保障动物性食品卫生安全，建立快速、敏感、准确的禽流感H7N9病毒检测方法是十分必要的。近年荧光PCR技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用,它利用PCR技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性,克服了常规血清学和普通PCR方法的不足,但是荧光PCR技术的检测下限仍很高，还不能检测出微量的病毒。

数字化PCR(DigitalPCR，dPCR)的概念早在1999年就由BertVogelstein采用并发表相关文献，其初衷是为了能够从临床样品(如尿液、淋巴液、血浆、粪便等)大量的正常体细胞中检测出微量的突变细胞，但由于当时能用于稀释样品的耗材只是384孔板，因此还不能非常好地体现数字PCR的核心理念——“无限稀释”(terminaldilution)。Bio-Rad公司的QX200系统核心的微滴化技术能够将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，本质上将传统定量PCR的一个test变成20,000个test，大大提高了核酸序列检测的灵敏度和精准度，是对“无限稀释”这一概念的完美演绎，其方法原理可称为微滴式数字化PCR(DropletDigitalPCR，ddPCR)。QX200ddPCR系统包括两台仪器：微滴发生器和微滴分析仪，及其相关的耗材。微滴发生器将每个样品分成20,000个均匀的纳升级微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。随后微滴转移至96孔PCR板上，开展终点PCR扩增。采用微滴分析仪(dropletreader)逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。与传统的定量PCR相比，数字PCR的精确度和灵敏度更佳。利用微滴式数字PCR技术，研究人员可以检测稀有突变，精确测定拷贝数变异，并对基因表达进行绝对定量。癌症相关突变因浓度较低，往往逃过检测。凭借QX200系统的高灵敏度，研究人员如今可检测浓度低至1/1,000,000的靶分子。

全世界的研究人员已利用系统开展了HIV、癌症和疾病鉴定等方面的开创性研究。利用ddPCR，加州大学的HIV研究人员能够证明一个出生时携带HIV的婴儿已被功能性治愈。目前，还没有将ddPCR应用于禽流感病毒绝对定量检测的报道，虽然ddPCR有望用于癌症筛查、传染病的诊断、食品中转基因成分的定量以及水质监测，但由于目前禽流感病毒容易发生变异，特别是我国2013年发生的人感染禽流感病毒H7N9亚型就是一个新的变异基因，致使对新发现的AIVH7N9的检测工作滞后，无法有效地实现对该亚型病毒的精确、准确、灵敏、高效、特异地检测。因此，亟需一种能够绝对定量检测AIVH7N9的方法，以应用于流行病学调查、疫情监控、口岸检验检疫以及食品卫生保障领域。

发明内容

本发明的目的是提供用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物和探针组合。

本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度的、操作简单的检测禽流感病毒H7N9亚型的检测试剂盒。

本发明提供了用于检测禽流感病毒H7N9亚型的特异性引物组合，包括以下2对特异性引物对和2条分别与引物对配合使用的特异探针，其核苷酸序列分别为：

HA-F：CCAGTGCATGTAGGAGATCAG

HA-R：ACTTAGTCATCTGCGGGAAAG