[发明专利]一种高效表达中华绒螯蟹甲壳素的酿酒酵母工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种高效表达中华绒螯蟹甲壳素的酿酒酵母工程菌，属于生物技术领域。

背景技术

水产养殖业是我国经济出口创汇的重要产业之一，渔业在我国已成为农业经济的增长点。近年来甲壳类动物病害日趋严重，给我国水产养殖业带来巨大的经济损失。

甲壳类动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的先天性非特异性免疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。甲壳类动物的非特异性免疫机制包括甲壳和粘液的屏障作用、网状内皮系统的吞噬作用以及非特异性体液分子。甲壳动物的抗菌肽，是具有较高抗菌活性，水溶性好，热稳定的免疫效应因子，能够直接杀死或者清除病原微生物，是甲壳动物先天免疫系统中的重要组成部分。多数抗菌肽具有广谱抗菌作用，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有不同程度的杀菌或者抑菌作用。甲壳素(Crustin)是虾蟹中研究较多的抗菌肽。

目前，中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)甲壳素Crustin基因全长已被克隆，也有研究学者将中华绒螯蟹Crustin基因在大肠杆菌中进行原核表达，但大肠杆菌表达体系常会导致蛋白聚集形成不溶的无活性的包涵体，复性过程繁琐，产出率低等因素大大提高工业生产的成本。而利用酿酒酵母对中华绒螯蟹甲壳素Crustin进行真核表达及蛋白功能研究至今仍未有报道。众所周知，基因的异源表达受到宿主、载体、启动元件等多种因素的影响。因此，如何实现甲壳类动物来源的Crustin的异源表达、活性表达、高效表达是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明利用酿酒酵母构建真核表达载体，实现了中华绒螯蟹甲壳素Crustin进行高效活性表达。本发明构建的酿酒酵母真核表达工程菌株必将在水产养殖上发挥重要作用。

本发明的第一个目的是提供一种高效表达中华绒螯蟹抗甲壳素的酿酒酵母工程菌，所述基因工程菌的构建方法是将中华绒螯蟹甲壳素EsCrustin(EsCrustin代表来源于中华绒螯蟹的Crustin)的cDNA克隆至表达质粒pHAC181上得到测序验证正确的重组质粒pHAC181-EsCrustin，然后设计同源重组引物，利用同源重组技术将目的基因EsCrustin整合至酿酒酵母宿主菌株的GAL1启动子下游。该工程菌在半乳糖的诱导下，可高效表达目的蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述EsCrustin的cDNA的CDS(codingsequence)区域翻译后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述EsCrustin的cDNA的CDS区域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒pHAC181是在商业化质粒YCplac181的SphI和EcoRV位点插入3个组氨酸标签得到的，详见文献：AnalysesoftheeffectsofRck2pmutantsonPbs2p^DD-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifyaMAPkinasedockingmotif,andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidicsubstitutionofT379,MolGenGenomics,2004,271:208–219.

在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌株为酿酒酵母GAL1-ScRCH1，是将酿酒酵母BY4741(Sc04153268_s1)菌株里的ScRCH1基因的启动子替换成GAL1启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌是按照如下方法构建得到的：(1)以中华绒螯蟹组织的cDNA为模板PCR扩增或者直接化学合成，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的EsCrustin基因片段；(2)将EsCrustin基因片段克隆到表达质粒pHAC181上，得到重组表达质粒pHAC181-EsCrustin；(3)设计同源重组引物，对质粒pHAC181-EsCrustin进行扩增，得到含有EsCrustin基因的核苷酸片段，使用同源重组的方法，将该核苷酸片段整合至酿酒酵母菌株中GAL1启动子下游，并使用引物进行PCR检测，有EsCrustin基因片段扩增出的转化子即为同源重组成功的菌株Gal-pHAC181-EsCrustin。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)，还包括将菌株在YPG培养基中诱导培养6h后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBLOT检测，目的蛋白表达的菌株则为构建成功的酵母工程菌。