[发明专利]一种米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法，属于仪器检测技术领域。

背景技术

米酵菌酸(Bongkrekicacid，RA)是椰毒假单胞菌产生的一种毒素，食入该毒素污染的食物可引起人或动物中毒，重者可致死亡。20世纪30年代研究人员从引起人中毒的椰子发酵食品样品中提取出该毒素，并对该毒素的理化性质和致毒机制进行了大量研究，近年来米酵菌酸又作为研究抗肿瘤疾病和细胞凋亡的一种工具试剂来使用。我国70年代从酵米面中毒样品中分离出一种称为“酵米面黄杆菌”(Flawbacwteriumfarinofennentansnosp)的食物中毒菌，其产生的外毒素-酵米面黄杆菌毒素A(简称黄杆菌毒素A，flavotoxinA)现证明即为米酵菌酸。

米酵菌酸是椰毒假单胞菌产生的一种毒素，食用被其污染的酵米面和变质鲜银耳常引起中毒，其分子式C₂₈H₃₈O₇，分子量486.61，化学名为3-羧甲基-17-甲氧基-6、18、21-三甲基二十二碳-2、4、8、12、14、18、20-七烯二酸。对人动物和多种真菌有毒，对热稳定，因而熟食也可中毒，而对酸性条件、氧化剂和日光不稳定。

米酵菌酸作为酵米面中毒和银耳中毒的病原菌产牛的毒素之一，具有很强的生物活性，是椰毒假单胞前引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物。临床症状表现为恶心呕吐、腹痛腹胀等，重者出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、抽搐、血尿、血便等肝脑肾实质性器官损害症状。动物实验亦表明，米酵菌酸主要作用于肝、脑和肾等实质性脏器且以细胞内的线粒体最为敏感。

米酵菌酸的毒性最早认为是干扰糖代谢，以后人们一直研究其机制。1959年Welling等通过动物试验发现米酵菌酸可抑制丙酮酸、α-酮戊二酸和苹果酸的氧化，对磷酸化过程的抑制更为明显。1970年Henderson以大鼠线粒体为材料证明了对氧化磷酸化的抑制部位不在呼吸链，而是线粒体膜上的ADP转运过程。Weldemamt发现米酵菌酸增加ADP与线粒体内膜的亲合力，阻断ADP转运。Lauquin则证明米酵菌酸在线粒体内膜上与ADP载体形成复合物。于是吴洪娟认为由于米酵菌酸与腺嘌呤载体ANT(电压依赖性阴离子通道)的结合，成为ANT的特异性非竞争性抑制剂，阻碍了ADP与ATP在线粒体内膜的交换，使ATP生成减少或消失；由于缺乏ATP，细胞膜上的离子泵不能发挥正常功能而效率低下，引起细胞内水钠潴留，细胞水肿；线粒体内膜依赖ATT’的机制停止工作，造成水钠潴留，从而引起线粒体肿胀，嵴变短、模糊直至消失。作为细胞内进行呼吸作用和能量交换的重要场所及细胞内主要的供能器官--线粒体，它的功能消失必将导致细胞、机体的死亡。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简便、定性定量能力较强的米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法，根据米酵菌酸的肉酸性特性，本发明采用弱阴离子交换柱，吸附剂上修复的是强碱性基团，保留弱酸性物质粒径33μm，孔径85μm，表面积800m²/g，离子容量0.60meq/g。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供的米酵菌酸的液相色谱-串联质谱检测方法，包括下列步骤：

(1)样品前处理

准确称取经过粉碎、均质过的待检测样品2.0g，加入20mL甲醇溶液均质提取米酵菌酸，再加入0.5g氯化钠；以上样品密闭避光振荡1h，再超声10min，4000r/min离心3min，取上清液。

(2)富集和净化

首先以1mL甲醇和1mL超纯水活化弱阴离子交换柱，活化过程流速控制在1-2滴/秒，取2mL上清液过弱阴离子交换柱进行富集，流速控制在1滴/秒，接着再以25mM乙酸铵(pH6-7)溶液和甲醇各1mL淋洗弱阴离子交换柱，以去除杂质，最后以1mL5％甲酸甲醇溶液洗脱米酵菌酸，待液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测。

(3)LC-MS/MS检测

液相条件PhenomenexC18色谱柱(3.0mm×150mm，5μm)，柱温30℃；进样量10μL；流动相A为水(含有0.1％甲酸，5mmol/L甲酸铵)，B为95％乙腈(含有0.1％甲酸，5mmol/L甲酸铵)；梯度洗脱条件见表1：

表1梯度洗脱条件