[发明专利]一种来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶、含所述脱饱和酶的载体、重组微生物及其应用

说明书

本发明涉及如SEQ ID NO.3的编码寄生疫霉ω‑3脱饱和酶的重组核酸序列、含所述ω‑3脱饱和酶的载体、含有所述载体的重组微生物特别是重组酿酒酵母菌，还涉及重组酿酒酵母菌的构建方法，以及所述含有所述脱饱和酶的酿酒酵母在多不饱和脂肪酸生物合成中的用途，其在常温下能够将C20:4^Δ5,8,11,14催化为C20:5^{Δ5,8,11,14,17}，催化效率达到65％。

【技术领域】

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用微生物合成多不饱和脂肪酸，具体涉及一种用于合成多不饱和脂肪酸的ω-3脱饱和酶、含所述ω-3脱饱和酶的载体、含有所述载体的重组微生物及其应用。

【背景技术】

长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)是指含有20个或20个以上碳原子的多不饱和脂肪酸，按照第一个双键距离C端的位置可以分为ω-6和ω-3两类。ω-3LC-PUFAs在人体内无法自行合成，需要从饮食中获取，属于必需脂肪酸，如EPA和DHA。研究发现，以EPA和DHA为代表的ω-3LC-PUFAs可以作为合成某些激素的前体物质，具有多重生理功能和潜在的药用价值。迄今为止，ω-3LC-PUFAs的来源以深海鱼类为主，然而从中提取的LC-PUFAs却存在稳定性差、纯化工艺复杂、易氧化等缺点。近年来，微生物作为一种新的LC-PUFAs来源正受到越来越广泛的关注：海洋藻类通过自养、异养和混合营养的方式生长，生长周期短，是EPA和DHA的初级生产者，也是ω-3LC-PUFAs最有潜力的来源之一；酵母菌、霉菌等研究成本低、适合大规模生产且遗传背景明细，拥有生产多种LC-PUFAs的潜力。随着分子生物学和生物技术的飞速发展，人们将越来越多的目光投向了产油真菌，以期通过基因工程改造菌体脂肪酸合成路径来生产EPA、DHA，但由于效率低下等原因，至今仍未实现商业化。

自然界中ω-3LC-PUFAs通常由LA和ALA起始合成，经过一系列去饱和酶和延长酶催化，最终形成EPA和DHA。其中，ω-3脱饱和酶是ω-3LC-PUFAs合成过程中的关键酶之一，具有三个富含组氨酸的结构域，能将ω-6多不饱和脂肪酸如LA(C18:2)、GLA(C18:3)、DGLA(C20:3) 和ARA(C20:4)分别催化生成对应的ω-3多不饱和脂肪酸ALA(C18:3)、SDA(C18:4)、ETA(C20:4)和EPA(C20:5)。

研究发现，不同来源的ω-3脱饱和酶对不同碳链长度的脂肪酸具有不同的催化效率。目前，已知的来源于藻类和植物的ω-3脱饱和酶只能催化18C的ω-6多不饱和脂肪酸如LA和GLA。而来源于秀丽隐杆线虫的ω-3脱饱和酶FAT 1则能同时以18C和20C的多不饱和脂肪酸为底物，但其中对20C底物的催化活性很低。随后，Pereira等人发现来源于异枝水霉的ω-3脂肪酸脱饱和酶sdd17对18C的多不饱和脂肪酸没有催化活性，却能将20C的ARA催化为EPA，转化率为25.9％。同样的，来源于致病疫霉的ω-3脱饱和酶OPIN 17也不能以18C的多不饱和脂肪酸为底物，但是对ARA的转化率达到了30.94％。

近年来，Xue等人从瓜果腐霉、大豆疫霉菌、栎树猝死病菌中分离出三种ω-3脱饱和酶——PaD 17、PsD 17和PrD 17并在重组解脂酵母菌中实现异源表达(Identificationand characterization of newΔ-17fatty acid desaturases,Appl MicrobiolBiotechnol(2013)97:1973–1985)。这三种酶既能催化18C又能催化20C的多不饱和脂肪酸，但偏好催化20C底物ARA。通过对这些偏好催化20C脱饱和酶的进一步研究发现，其在常温下对ARA有较高的转化率，实现了常温下生物积累EPA。这一类偏好以20Cω-6LC-PUFAs为底物催化合成ω-3LC-PUFAs的脱饱和酶可以直接、高效地催化ARA生成EPA，为通过延长酶催化合成DHA提供了底物，对于生物合成法生产ω-3LC-PUFAs具有十分重要的意义。为了提高生产效率，筛选此种高效催化ARA合成EPA的脱饱和酶显得尤为重要。这将为构建高产ω-3LC-PUFAs的工程菌，常温发酵生产EPA、DHA，打下坚实的基础。