[发明专利]一种制备狂犬病活载体疫苗的方法及其产品和用途

权利要求书

1.一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒G蛋白和细菌鞭毛蛋白制备狂犬病活载体疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)制备目的基因：

设计引物，通过PCR的方法扩增出狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因；

(2)构建重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体：

将步骤(1)扩增的到的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因一同插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，检测抗原蛋白G基因以及FIjB或FIiC基因是否已经整合到腺病毒穿梭载体中，构建得到含有G-FIjB或G-FIiC的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，命名为PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC；

(3)获得复制缺陷型腺病毒质粒：

将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC与腺病毒骨架载体PAdEasy-1通过在大肠杆菌中进行质粒间同源重组从而得到重组腺病毒质粒；

(4)用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下操作：

1)用Pac I酶切步骤(3)得到的重组腺病毒质粒，

2)转染293细胞，

3)接种293细胞，

4)获得基因组结构均一的重组腺病毒，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是于步骤(1)中用于扩增抗原蛋白基因G和细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因的扩增引物为：

GF：5’GCAGATCTGCCACCATGGTTCCTCAAGCTCTTTTG 3’

GR：5’GCGTCGACTCACAGTCTGATCTCACC 3’

FIjBF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTAATCAACACT 3’

FIjBR：5’GCTCTAGATTAACGTAACAGAGACAGC 3’

FIiCF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTCATTAATACA…3’

FIiCR：5’GCAAGCTTTTAACGCAGTAAAGAGAG 3’

其中，ATG为起始密码子；狂犬病病毒G基因以狂犬病毒aG毒株为模板使用 引物对GF/GR进行扩增；细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因分别以鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白基因为模板使用引物对FIjBF/FIjBR或FIiCF/FIiCR进行扩增。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(2)中，所述的腺病毒载体启动子为CMV；终止子为PolyA；所述的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体的构建包括以下操作：

1)将扩增得到的目的基因G经Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；

2)同时，将腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV经Bgl Ⅱ、Sal Ⅰ双酶切，得到线性化的载体；

3)使用T4DNA连接酶对上述产物进行粘端连接；

4)按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；

5)采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为PAdTrack-CMV/G；

6)将回收得到的目的基因FIjB经Sal Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切，目的基因FIiC经Sal Ⅰ、HindⅢ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；

7)同时，将阳性重组质粒PAdTrack-CMV/G分别经Sal Ⅰ、Xba Ⅰ双酶切或Sal Ⅰ、HindⅢ双酶切，得到线性化的载体；

8)使用T4DNA连接酶对步骤(6)和(7)的产物进行粘端连接；按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC。