[发明专利]一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂及其制备方法

权利要求书

1.一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂，其特征在于该制剂包括免疫细胞、人血白蛋白和复方电解质，所述免疫细胞包括DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞；其中免疫细胞浓度为1×10⁷个细胞/ml～5×10⁷个细胞/ml，人血白蛋白浓度为1～2g/100ml。

2.根据权利要求1所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂，其特征在于免疫细胞浓度为2×10⁷个细胞/ml～4×10⁷个细胞/ml。

3.如权利要求1所述的一种治疗肿瘤的多细胞免疫制剂的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、自体血浆的制备：

①采集成人外周血，抗凝剂为枸橼酸钠，将采集到的血液转移至离心管中，离心收集血浆；

②将收集到的血浆进行灭活处理，56℃水浴30～50min，水浴完毕后，离心收集上清液，即为自体血浆，待用；

二、外周血单个核细胞PBMC的分离：

①将Ficoll溶液分至离心管中，待用，将成人外周血血细胞与复方电解质按照体积比1～2：1混合均匀，得稀释后的细胞悬液，将稀释后的细胞悬液添加至装有Ficoll溶液的离心管中，细胞悬液与Ficoll溶液的体积比为1.5～2.5：1；

②将离心管转移至离心机，2000rpm，离心20～30min；

③收集白膜层细胞并用复方电解质离心洗涤两次，最终用复方电解质重悬细胞并计数备用，即得到外周血单个核细胞PBMC；

三、DC的制备：

①将步骤二收集得到的PBMC用RPMI-1640培养基将浓度调整为1×10⁶个/ml～3×10⁶个/ml，接种于细胞培养瓶内，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育2～4h，使DC细胞前体贴壁；

②然后收集悬浮细胞，平均分为4份，待用；

③向贴有DC细胞的培养瓶中加入GT-T551培养基，同时向培养瓶的培养液中添加rhGM-CSF、rhIL-4和自体血浆上清；

④每隔两天对细胞进行半量换液，同时补足细胞因子rhGM-CSF和rhIL-4至终浓度均为500～1000U/ml，并加入培养液体积2％的自体血浆上清；

⑤培养第6天时添加rhTNF-α至终浓度为500-1000U/ml；

⑥培养第8天时，收集树突状细胞DC，并留样进行流式检测，计数，冻存于-80℃冰箱内，并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，培养14天时，复苏DC；

其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD83⁺>40％，CD86⁺>50％，CD11c⁺>50％，HLA-DR⁺>60％；

四、CIK的制备：

①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加IFN-γ和自体血浆上清，置于37℃，7.5％CO₂培养箱中培养；

②培养第1天加入启动因子rhIL-2至终浓度为4000IU/ml，再加入OKT3至终浓度为5-10μg/ml；

③培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.5×10⁶个/ml-2×10⁶个/ml时，添加GT-T551培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有1000-2000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；

④培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CIK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3⁺CD8⁺>60％，CD3⁺CD56⁺>20％；

五、NK细胞的制备：

①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，并离心收集细胞，接种于培养瓶内使用GT-T561培养基重悬细胞，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×10⁶个/ml-1.8×10⁶个/ml时，添加GT-T561培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；

③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到NK细胞；

其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3^-CD56⁺>80％；

六、CD3AK的制备：

①取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种于培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2、OKT3和自体血浆上清，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×10⁶个/ml-1.8×10⁶个/ml时，添加RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；

③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到CD3AK细胞；其中要满足细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD3⁺>50％，CD8⁺>30％，CD25⁺>20％，CD56⁺>20％；

七、γδT的制备：

①用RPMI-1640培养基将TCRγδ单克隆抗体稀释，终浓度为1μg/ml，包被培养瓶，37℃孵育2h，弃掉包被液，用RPMI-1640培养基清洗培养瓶，并取步骤三中收集到的悬浮细胞1份，接种至培养瓶内，向培养瓶的培养液中添加rhIL-2和自体血浆上清，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

②培养时，对细胞密度进行检测，当细胞密度达到1.2×10⁶个/ml-1.8×10⁶个/ml时，添加RPMI-1640培养基并扩大培养，其中添加的培养基中含有500-1000IU/ml的rhIL-2和自体血浆上清，自体血浆上清的体积为培养基体积的2％；

③培养14天时收集细胞并留样进行细菌、真菌、内毒素和流式检测，即得到γδT细胞；

其中要满足细细菌和真菌检测结果为阴性，内毒素检测结果不高于0.25EU/ml，流式检测结果要求CD4⁺>30％，CD25⁺>50％；

八、多细胞免疫制剂的制备：

①将冻存后复苏的DC细胞、CIK细胞、NK细胞、CD3AK细胞和γδT细胞分别进行洗涤：使用复方电解质对细胞进行离心洗涤，洗涤3次后用复方电解质重悬细胞，分别得到5种细胞悬液；

②然后使用200目的滤器过滤细胞悬液，并取样计数，计活，细胞活率不低于95％；

③将过滤后的细胞悬液混合得免疫细胞，将免疫细胞转移至回输袋中，并添加复方电解质和人血白蛋白，即得到治疗肿瘤的多细胞免疫制剂。