[发明专利]肺炎克雷伯菌荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中肺炎克雷伯菌核酸的试剂盒，属于肺炎克雷伯菌的体外诊断领域。

背景技术

肺炎克雷伯菌（Kpn）属于革兰氏阴性杆菌，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，为呼吸道感染的重要病原体，对人的致病性较强，常引起重症肺炎，多发于住院的衰弱患者；当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或者小叶融合性实变，以上叶较为多见，病变中渗出液粘稠而重，致使叶间隙下坠。在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。

本发明针对肺炎克雷伯菌基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-timePCR的方法，用来快速检测样品中是否存在肺炎克雷伯菌的核酸。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在肺炎克雷伯菌，提供一种特异性检测肺炎克雷伯菌的荧光PCR试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种特异性检测样品中肺炎克雷伯菌核酸的试剂盒，其组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品，其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含有肺炎克雷伯菌检测靶序列的重组质粒。

其中PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对肺炎克雷伯菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1，Probe1为针对肺炎克雷伯菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团X₁为CY5，荧光淬灭基团Y₁为BHQ（见表1）。

表1检测肺炎克雷伯菌的引物和探针序列

名称序列P15`- CCTGCATCAGACTGTCCAGTA -3`P25`- CCATCTCGGTACAGTTTC -3`Probe15`-X<sub>1</sub>- CAGCGTAATAACGTAGGGCGTGTAGC -Y<sub>1</sub> -3`

本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测肺炎克雷伯菌的应用方法，包括：

试剂盒选用的PCR反应体系为20μL，包括2×PCR缓冲液10μL、10mmol/LdNTP1.0μL、25μmol/L引物各0.5μL、10μmol/L探针0.2μL、热启动Taq酶混合液0.4μL、样品DNA2μL，加灭菌水至终体系20μL。

试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。

结果判读：

阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。