[发明专利]一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法

说明书

本发明公开一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，通过胶孢炭疽病菌原生质体的制备、转化和转化子的筛选，将含有筛选标记的外源DNA片段转到胶孢炭疽病菌基因组中；本发明实现了胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化，建立了一套完整的遗传转化方法，获得大量高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化子，转化效率可达20‑22个转化子/ug DNA，转化效率高、稳定性好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法。

背景技术

胶孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的梨炭疽病是一种世界性的植物病害，给世界农业生产造成严重的经济损失。近几年来，梨炭疽病多在我国黄河故道梨产区发生，尤其对砀山酥梨危害明显。2008年，砀山地区暴发梨炭疽病，病果率达到70%以上，给农业生产造成严重的经济损失（“梨胶胞炭疽病菌的分离、鉴定及其生物学特性”，刘邮洲等，江苏农业学报，2013，29（1）：60-64）。由于炭疽菌种类繁多，同属不同种炭疽菌在生物学特性、遗传多态性及致病机理等方面存在较大差异，至今鲜有对梨胶孢炭疽病菌的致病机理的报道，这也限制了对胶孢炭疽病菌侵染和致病机制的深入认识。

胶孢炭疽病菌的遗传转化是研究其生长发育与致病过程分子机制的基本工具，目前已有多种遗传转化技术在炭疽菌研究中得到应用，其中包括CaCl₂/PEG介导的原生质体转化法（“杨树炭疽病菌原生质体遗传转化的建立及绿色荧光蛋白的表达”，李思蒙等，林业科学，2013，49（5）：121-127）、根癌农杆菌介导的方法（ATMT）（“The use of T-DNA taggingto isolate mutants of Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum acutatum with reduced virulence against Hevea brasiliensis”，Lin，ForestPathology，2013，43：289-296）、电穿孔转化（“Genetic transformation with the gfpgene of Colletotrichum gloeosporioides isolates from coffee with blisterspot”，Armesto et al，Brazilian Journal of Microbiology，2012：1222-1229）等。ATMT虽操作简便，但转化时间长，工作量大，适用于突变体库的构建；电穿孔转化法转化效率低，目前极少在真菌转化中应用；CaCl₂/PEG是目前较为传统的转化方法，其操作步骤简便有效，可用于目的基因敲除和替换，已成为获得转化子的最普遍的转化技术。

在CaCl₂/PEG转化过程中，原生质体的数量和转化质粒在胶孢炭疽病菌的转化过程中至关重要，直接影响转化效率，一是因为原生质体的数量与菌龄、菌量、酶解液的组分及酶解时间等因素密切相关；二是转化质粒与所用载体（包括启动子、报告基因和所含的抗性标记等）以及质粒浓度等密切相关。因此，目前尚未见高效、稳定的胶孢炭疽病菌遗传转化体系相关报道。

发明内容

针对上述内容，本发明提供一种高效、稳定的PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，本发明是这样实现的：

一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，具体步骤如下：