[发明专利]线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒

说明书

本发明属于生物技术检测领域，公开了一种线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒。首先由一对PCR扩增引物对分型目的区域即954bp基因组全长序列进行PCR扩增反应，然后通过四条正向和反向测序引物对扩增产物进行双向测序反应。本发明的贡献在于建立精确、稳定、可靠的12S rRNA基因组全长序列的测序分型方法。所获得的碱基序列峰图中无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。该方法可对12S rRNA基因组全长序列进行测序分型，解决了测序分型中出现的模棱两可结果；该方法适合于12S rRNA基因分型，以及12S rRNA基因的群体遗传学、进化学以及疾病相关性等基础和应用研究工作。

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，涉及一种线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型的方法及试剂盒。

背景技术

自从1993年Prezant等在一个非综合征型母系遗传的阿拉伯-以色列耳聋家系中首次发现线粒体12S rRNA基因的A1555G突变以来，在不同国家、不同种族的家系和散发耳聋患者中均已证实线粒体12S rRNA基因突变与氨基糖苷类药物致聋和非综合征型耳聋有关。截止2015年2月，NCBI数据库公布有36个线粒体12S rRNA基因单核苷核多态性(SNPs)位点，其中有7个位点与氨基糖甙类药物致聋或/和非综合征型耳聋相关，包括：A827G、T961G、T1095C、T1291C、C1494T、A1555G和G1598A。A1555G和C1494T是中国人群药物性耳聋基因突变的主要位点，位于线粒体12S rRNA的高保守A位点，彼此并列但不形成碱基对。G1555或T1494突变形成了新的G-C或A-U的碱基对，使得12S rRNA的二级结构更为紧密，改变氨基糖苷类药物(如巴龙霉素、新霉素、庆大霉素、卡那霉素等)与12S rRNA A位点的结合性能，以致A1555G或C1494T突变携带者在使用氨基糖苷类药物时可以诱发或者加重听力损伤。

A1555G突变相关耳聋在全世界均有报道，且在不同人群中其突变携带率不同。在亚洲耳聋人群中携带率为20～30％，英国和意大利南部的语前耳聋患者中携带率为6％。携带A1555G突变的个体对氨基糖苷类药物表现为高敏感性，可导致极严重的永久性耳聋。即使给予安全范围内的氨基糖苷类药物治疗，也可能导致严重的不可逆的耳聋。在同一母系的家庭成员中，携带A1555G突变的个体的临床表型存在异质性，从严重的语前耳聋到较轻的晚发型进行性耳聋，也有一些携带者表现为听力正常。携带该突变的个体即使不使用氨基糖苷类药物也可能导致耳聋的发生。另一个重要突变位点为C1494T，其突变发生率低于A1555G，在1624名中国耳聋人群中只有3位患者携带该突变。在没有使用氨基糖苷类药物情况下，C1494T突变家系的一些母系成员表现为迟发型或渐进性耳聋，听力损伤程度和发病年龄差异性也较大，而氨基糖苷类药物的使用可以促使家系中患者发病年龄提前或耳聋表型加重。

以聚合酶链反应(PCR)为基础的测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际基因分型的金标准，但至今尚无商品化12S rRNA测序分型试剂盒应市。目前报道的12S rRNA荧光检测试剂盒或限制性片段长度多态性聚合酶链反应 (PCR-RFLP)，仅能鉴定部分的12S rRNASNPs位点(C1494T和A1555G)，无法达到精细的等位基因水平和甄别全部的变异体，限制了等位基因水平12S rRNA在群体遗传学、耳聋等疾病关联的研究及临床中的应用。其次，国际上迄今尚无公认的12S rRNA测序分型方法，业已报道的方法存在以下问题：(一)是仅对部分基因序列进行了直接测序分型，测序分型没有涵盖12S rRNA基因组全长序列，不利于12SrRNA基因组全长序列的多态性及其功能的研究，易出现模棱两可的测序分型结果。(二)是测序分型时PCR扩增的目的分型片段虽涵盖了基因组全长序列，但是需要扩增多条产物片段，实验费时费力。随着越来越多12S rRNA SNPs位点的报道、12S rRNA SNPs位点与氨基糖苷类药物致聋和非综合征型耳聋等疾病关联研究的开展和深入，建立精确、操作方便的线粒体12S rRNA基因组全长序列测序分型方法以达到等位基因水平的基因分型并解决模棱两可结果是迫在眉睫。

发明内容