[发明专利]基于抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和吸附材料

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于单域重链抗体(又称纳米抗体技术)的免疫亲和 吸附材料，特别是针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料。

技术背景

黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉菌、寄生曲霉菌等真菌产生的剧毒次 级代谢产物。它们的化学结构类似，为二呋喃香豆素衍生物，主要包括黄 曲霉毒素B₁(AFB₁)、B₂(AFB₂)、G₁(AFG₁)、G₂(AFG₁)和M₁(AFM₁) 等。在天然污染的食品和饲料中，AFB₁的污染最为常见，其毒性和致癌性 也最强，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为I类致癌物。世界各国及 地区指定了严格的黄曲霉毒素限量标准，例如欧盟婴幼儿食品中AFB₁允 许量≤0.10μg/kg。

现有的黄曲霉毒素检测方法主要有仪器分析法、免疫分析法以及薄层 层析法。其中仪器分析法具有灵敏度高、准确性和重复性好等优点，但是 对于分析样品前处理要求较高，需要尽量去除样品中的杂质以减少对后续 检测的干扰。传统的前处理方法有液相萃取、固相萃取等，处理过程繁琐 且特异性不高。亲和层析技术基于配基与待测物质之间特异性的识别，可 通过一步操作实现对复杂混合样品中待测物的分离纯化。目前使用的黄曲 霉毒素亲和纯化介质一般采用多克隆抗体或单克隆抗体作为配基，存在不 耐有机试剂、活性迅速降低的问题。因此，需要开发活性高、稳定性好的 新型配基替换传统抗体。单域重链抗体是由羊驼重链抗体的可变区组成， 又称为纳米抗体，具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特性，相较于传统 抗体具有明显的优势。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料及其 应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

针对黄曲霉毒素的免疫亲和吸附材料包括载体和配基，所述配基为单 域重链抗体，具有SEQIDNO.：1所示的氨基酸序列。该配基可特异性识别 黄曲霉毒素。

所述配基还可以为在前述单域重链抗体基础上通过随机或定点突变 技术进行改造所获得的能与黄曲霉毒素特异性结合的抗体。

所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。

上述黄曲霉毒素免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征为：

所述载体为磁珠时，制备方法为：取1mg羧基磁珠于离心管中，加 入500～1000μl活化缓冲液(10mM，NaH₂PO₄，pH6.0)，涡旋混合均匀， 磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤2遍。分别加入1～5mg碳二亚胺 (EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，涡旋混合后，静置30min。用偶 联缓冲液(10mM，Na₂HPO₄，pH7.4)洗涤磁珠3遍，加入抗黄曲霉毒 素单域重链抗体，室温反应2～6h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重 链抗体的免疫磁珠；

所述载体为琼脂糖凝胶微球时，制备方法为：将CNBr活化的干胶用 0.1MHCl洗涤10～15次，每次平衡5～10min。用偶联缓冲液(10mM， Na₂HPO₄，pH7.4)洗涤5～15次，加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，室 温反应2～10h，得到共价偶联了抗黄曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和 吸附材料；

所述载体为硅胶微球时，制备方法为：将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲 液(PBS，10mM，pH6.0)交替洗涤5～10次，用PBS缓冲液悬浮硅胶微 球，加入抗黄曲霉毒素单域重链抗体，混匀，加入终浓度1～10mg/ml的碳 二亚胺(EDC)，迅速混匀，4℃搅拌反应12～24h，得到共价偶联了抗黄 曲霉毒素单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。

将上述免疫亲和吸附材料(载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球)装填 至层析柱，即得到黄曲霉毒素免疫亲和层析柱，方法为：根据层析柱容量， 取适量上述免疫亲和吸附材料于层析柱，加入5～10倍柱床体积的PBS(10 mM，pH7.4)洗涤后，4℃，保存于20％乙醇溶液。