[发明专利]一种制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种由生物催化技术制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，属于生物制药工业技术领域。

背景技术

(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶是一种重要的药物中间体，被广泛应用于镇痛、抗精神病、抗肿瘤等药物的合成，如药物依鲁替尼。该药物于2013年底在美国上市，保守预计2018年全球销售额可以达到23.2亿美元。

目前，光学活性的(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶化合物可通过化学或酶促方法拆分外消旋体获得。但是拆分方法的局限性在于最大理论收率为50％，分离提取也较为繁琐(USpatent2011092698A1，WO2011036280A1)。

生物催化羰基不对称还原，其最大理论产率及对映体过量值为100％，且反应体系简单，绿色环保，是手性醇生产的重要方法之一。目前已发掘的制备该中间体的生物催化剂大多来自于生物离体组织(如磨碎的野生胡萝卜根)，细菌，真菌等，也有重组羰基还原酶生物催化的报道。然而，这些催化剂大多获取困难，立体选择性不高，底物耐受性差，转化率较低，从而导致时空产率低，没有良好的工业化经济效益(Org.Lett.2009，11，1245-1248；OPRD.2014,18,827-830；CN104603278A，CN103276027A，CN103923957A，CN103571908A，CN103131734A，WO2013190341A1)。

发明内容

本发明旨在提供一种高产率，高立体选择性及高时空产率的羰基还原酶催化前手性酮N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮制备(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶的方法，以满足工业化生产需求。

本发明涉及用于制备式(I)的化合物方法：

(S)-N-叔丁氧羰基-3-羟基哌啶

所述方法包括在还原型辅酶或者辅酶再生体系(包括氧化型辅酶，氢供体及偶联酶)存在的情况下，用羰基还原酶还原式(II)的化合物：

N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮

式(II)的化合物(在本文中也称为“底物”)在本领域是已知的。

本发明生物催化体系为：羰基还原酶、辅酶、底物、缓冲液。

在本发明中使用的羰基还原酶为ChKRED03(NCBI登录号为KC342003)，ChKRED08(NCBI登录号为KC342008)，ChKRED23(NCBI登录号为KC342023)或者ChKRED26(NCBI登录号为KC342026)。根据本领域一般常识，上述羰基还原酶可通过商业化的全基因合成服务得到。

根据本领域的一般常识，反应体系中可以用上述羰基还原酶构建的重组酶的休止细胞、粗酶液、纯酶或者粗酶粉等。为获得较高的转化效率，优选使用粗酶液。羰基还原酶的用量与底物用量比率优选为1％～6％(w/w)(羰基还原酶以粗酶液的总蛋白量计)。

本发明的辅酶可以为NADH或者NADPH或者构建一个可以产生这两种还原型辅酶之一的辅酶再生体系。

本发明优选的辅酶再生体系为：葡萄糖脱氢酶GDH、氧化型辅酶NADP⁺、葡萄糖。葡萄糖脱氢酶为1～30U/mL，NADP⁺用量与底物用量比率为0.2％～0.9％(w/w)，葡萄糖的物质的量为底物物质的量的1.1～3倍。

本发明的底物为：N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮。底物优选加入助溶剂后添加到反应体系中，所述助溶剂是二甲亚砜、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮，浓度优选5％～25％(v/v)。根据本发明的有利实施例，助溶剂最优选于甲醇。

反应体系中底物终浓度优选1～250g/L。

本发明缓冲液优选Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液；缓冲液的pH优选6.0～8.0；缓冲液浓度优选0.1M；

本发明反应温度优选20℃～40℃，转速优选100～200rpm。

根据上述优选体系(合成路线见说明书附图1)，所述制备方法的实施过程如下：将底物充分溶解在甲醇中，然后加入到缓冲液中，搅拌均匀后，加入重组羰基还原酶，葡萄糖脱氢酶、氧化型辅酶、葡萄糖，维持在20℃～40℃，TLC或HPLC监控，至反应转化率达到99％以上，用甲基叔丁基醚终止反应。

在反应过程中，通过定期监测并添加常规的碱性试剂(例如碳酸钠和氢氧化钠)将反应体系的pH值保持在6.0～8.0的范围。