[发明专利]一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及环境微生物分析技术领域，具体涉及城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中全部微生物 的检测分析方法。

背景技术

生物气溶胶是指具有生命的气溶胶粒子(包括细菌、真菌、病毒等微生物粒子)和活性粒子(花粉、 孢子等)以及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒。污水中存在的多种微生物，在污水处理过 程中，曝气、机械搅拌及污泥脱水等环节可使其以气溶胶的形式释放周边的空气中。研究表明，城市污水 处理厂/处理站逸散的微生物气溶胶中含有大量的致病菌或条件致病菌，对污水处理厂/污水处理站工作人 员、附近居民健康及环境具有较大的潜在危害。因而，探明城市污水处理厂、污水处理站微生物气溶胶的 群落结构，解析生物气溶胶的微生物菌群在逸散过程中的演替规律逸散特征，对于污水处理厂微生物气溶 胶的控制及人员健康防护都具有重要的研究和指导意义。

目前，城市污水处理厂/处理站(wastewatertreatmentplant/station，简称WWTP/WWTS)逸散的微 生物气溶胶采集方法主要包括可培养方法和不可培养方法两种。

1)琼脂培养基-Andersen固体撞击式采样法是国际标准的可培养微生物气溶胶采集方法，可对微生物 气溶胶的群落结构、浓度以及粒径分布等特征进行研究。该方法为传统的微生物培养方法，操作繁琐，需 要大量的人力物力；而研究也表明，可培养的微生物仅占环境微生物的1％-10％，因而，该方法并不能高效、 有效地反映城市污水处理厂微生物气溶胶的分布及组成特征。

2)SKC-Sampler液体撞击式采样法是国际标准的微生物气溶胶不可培养采集方法，作为标准方法广泛 应用于气溶胶中全部微生物的收集，对于微生物群落信息能够较全面的反映。获取微生物气溶胶的DNA是 后续微生物特征解析的前提，但是，空气中的微生物数量相对于其他生境(土壤、水体)要低很多，不经 培养过程直接对空气中的微生物提取DNA是一直以来的难题。

SKC-Sampler液体采样器流量小(额定流量为12.5L空气/min)，要获取足够的样本量提取DNA需要 长时间的样品收集；该方法中的微生物气溶胶收集液(PBS缓冲液)在样品采集过程中会大量挥发，需要 反复添加收集液以保证其正常运行；同时，受制于其收集液在低温条件(＜0℃)下会结冰，该方法并不 能完成在任一时间的样品采集任务。

参考常见的大流量大气采样器(流量＞100L/min)的大气采样器一般安装于某固定采样点，而对于 不同污水处理厂/处理站之间的调研安排、以及多个采样点之间频繁更换的要求并不能满足。

以上缺点，使得两种国际标准的生物气溶胶采集方法，都不能实现对城市污水处理厂微生物气溶胶中 全部微生物的现场采样目的，以及后续的微生物群落结构及逸散特征的解析。

发明内容

本发明的目的在于提供一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中全部微生物高效采集和分析的方 法，即能够克服营养琼脂-Andersen固体撞击式采样法和SKC-Sampler液体撞击式采样法应用于城市污水 处理厂微生物气溶胶收集过程中的弊端。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法，包括以下步骤：

1)采样器及其配件准备，采样膜及其采样膜收集器具的准备及高温高压灭菌；

2)城市污水处理厂微生物气溶胶现场采样，运行空气采样泵，抽滤空气至无菌的玻璃纤维滤膜上， 截留空气微生物至采样膜上，记录采样过程中的气象参数；

3)采样膜的收集及存放，用无菌镊子将截留空气微生物的采样膜转移至无菌铝箔纸上密封，如不能 立即对样品进行后续处理，将其冻存-20℃或者-80℃的冰箱内待用；

4)DNA提取，提取玻璃纤维膜上的微生物DNA；

5)目的片段扩增，细菌16SrRNA和真菌18S基因PCR扩增；

6)高通量测序，利用高通量测序技术对细菌和真菌的目的序列进行测序；

7)序列分析，将下机的目的片段DNA序列对原始数据进行过滤处理，得到优化序列，去除嵌合体序 列后进行OTU聚类分析，对OTU的代表序列在Silva数据库中进行比对分析，鉴定微生物气溶胶中细菌和 真菌的分类；