[发明专利]获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法及其突变体

说明书

本发明涉及获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法及其突变体，属于生物技术领域。获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白DomainⅡ的loop2或/和loop3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10以上的氨基酸序列的改变。本发明连续多点突变体ModCry1Aid‑loop 2对棉铃虫的杀虫活性提高了约13倍；连续多点突变体ModCry1Ai‑loop 2对玉米螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高了近9倍；连续多点突变体ModCry1Ai‑loop 2和连续多点突变体ModCry1Ai‑loop 3对水稻二化螟的活性比改造前的Cry1Ai蛋白提高5倍‑6倍左右。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种获得高活性Cry1Ai蛋白突变体的方法，以及采用该方法获得的高活性的Cry1Ai蛋白突变体。

背景技术

cry1Ai基因为本申请人于2009年所克隆(专利号：ZL200910241558.8；束长龙等，2013)，其表达产物对亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)、小菜蛾(Plutellaxylostella)、水稻二化螟(Chilo suppressalis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)及家蚕(Bombyx mori)等鳞翅目昆虫具有较好的杀虫活性，但对棉铃虫(Helicoverpa armigera)仅具有体重抑制作用，在某种程度上限制了cry1Ai基因的应用范围。cry1Ah1(专利号：ZL200410009918.9；张杰等，2006)，其编码的Cry1Ah蛋白对棉铃虫、亚洲玉米螟和水稻二化螟等鳞翅目害虫具有很高的毒杀活性，而Cry1Ah蛋白对重要的经济昆虫家蚕却表现出较低的生物活性，显示出良好的环境安全性。Cry1Ah蛋白和Cry1Ai蛋白活性区域的氨基酸相似性为84％，两者DomainⅢ完全一致，Domain Ⅰ的差异集中定位在helixα-3、helixα-4和helixα-6上，在Domain Ⅱ的差异主要集中在loop 2和loop 3上。

近年来大量的研究表明，Cry蛋白上某些氨基酸位点或区域与杀虫特异性有关。Domain Ⅱ是Cry毒素结构中变化最多的结构域。主要是顶端的环(loop)，其长度、构象和序列都可以有很大的变化。Cry1A、Cry2A、Cry3A、Cry4A和Cry5A顶端loop的长度变化较大，Cry5A的loop最长，Cry3A的loop最短，由于Domain Ⅱ的多变性，该区域被认为是与Cry毒素作用的特异性有关。研究发现：Cry1Ab蛋白的loop 2上某些氨基酸与其对烟草天蛾的活性有关；Cry4Ba蛋白的loopα-8参与其与埃及伊蚊(Aedes aegypti)的结合过程；Cry11Ba蛋白的loopsα-8、1和3参与受体结合，并与对伊蚊的杀虫活性有关。Cry19Aa蛋白的loop 1中357W与其对尖音库蚊(Culex pipiens)的活性有关，loop 2中的410Y、416W、418D与其对尖音库蚊和埃及伊蚊的活性有关。但也有研究发现：Cry4Aa蛋白对尖音库蚊的活性相关区域不是Domain II的loops，可能是Domain III的某个位点。上述研究结果充分说明了Cry蛋白的loop区域与其杀虫活性有着密不可分的关系，但Cry类蛋白对棉铃虫杀虫特异性相关氨基酸区域尚无明确报道，且多数突变体为单点突变且活性大多丧失，是反面推测该位点可能与杀虫特异性相关的位点，而改变杀虫特异性、提高新活的成功案例较少。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种获得高活性Cry蛋白突变体的方法，采用多点连续突变的方法，得到了高活性的蛋白突变体。

本发明采用该方法，对Cry1Ai蛋白进行突变，获得的两个突变体，该两个突变体对某些鳞翅目害虫有毒杀效果有明显的提高。

获得高活性Cry蛋白突变体的方法，对Cry蛋白立体结构Domain Ⅱ的loop2或/和loop3中的氨基酸序列进行连续多点突变，所述连续多点突变为连续10个以上的氨基酸序列的改变。

所述Cry蛋白为Cry1Ai或Cry1Ah蛋白。