[发明专利]用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用

说明书

本发明公开了用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用，通过对已经报道的干酪乳杆菌基因组序列的比对分析，本发明提供了用于干酪乳杆菌定性定量检测的引物5’‑ TGCGGCGGTAAAGGTTG ‑3’、5’‑ CGTCTGTGTAGAAACTGCGAATG ‑3’，同时本发明提供了一种饲料样品的预处理方法，使得饲料中的益生菌可以充分释放，准确真实的反应出饲料中的益生菌数目。本发明可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测猪饲料中干酪乳杆菌，检测程序简单、检测效率高、准确性好，灵敏度高，重复性好。

技术领域

本发明属于畜牧兽医技术领域。更具体地，本发明涉及用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用。

背景技术

随着我国动物饲料中抗生素的禁用，新型的绿色添加剂的开发成为热点。目前益生菌制剂不断发展，但是在其定性、定量检测的方法还不够科学和快速，这在一定程度上限制了益生菌制剂的发展。通常采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的传统方法，极易因为菌种差异导致的检测效率受限、检测结果不稳定，除此之外，传统方法也会耗费大量的时间和资源。实时荧光定量PCR相对于PCR技术来说，是定性到定量的飞跃，因其特异性强、重复性好、准确和高效的特点成为分子生物学和微生物学领域非常重要的定量检测方法。通过种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立猪饲料中干酪乳杆菌的快速定性、定量检测方法，可以提高检测效率、简化检测程序，并促进饲料行业和养殖业的发展，为益生菌和饲料产业的快速和长远发展提供技术保障。

本申请针对猪饲料中含有的干酪乳杆菌，通过对已经报道的干酪乳杆菌基因组序列的比对分析，选取干酪乳杆菌的保守基因作为目的基因，自行设计干酪乳杆菌的基因序列的种属特异性引物，利用该引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立了猪饲料中干酪乳杆菌的快速定性和定量测定方法。

发明内容

用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物：5’-TGCGGCGGTAAAGGTTG-3’、5’-CGTCTGTGTAGAAACTGCGAATG-3’。

本发明的另一个目的在于提供了用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，方法简单，重复性高，结果准确。

本发明的另一个目的在于提供了一种用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物：5’-TGCGGCGGTAAAGGTTG-3’、5’-CGTCTGTGTAGAAACTGCGAATG-3’。

用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的检测方法，包括饲料样品预处理的方法，该方法包括：

经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4℃以100转/分的速度震荡1-2h，配成10％的均匀稀释液。对均匀稀释液进行10倍递增稀释，选择2个以上适宜的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。

用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒的应用，其应用包括利用该试剂盒制备成用于干酪乳杆菌的检测试剂，或利用该试剂盒进行干酪乳杆菌的定性检测，或利用该试剂盒进行干酪乳杆菌的定量检测，或利用该试剂盒同时进行干酪乳杆菌的定性和定量的检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明所采用的饲料样本的处理方法使得在益生菌的提取过程中，益生菌的扩增有限，同时饲料中的益生菌又可以充分释放，这样所测得值才能真实的反应出饲料中的益生菌数目，为一种特异的适用于饲料中干酪乳杆菌提取方法，为本发明首创。