[发明专利]一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法

权利要求书

1.一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，通过以下步骤实现：

(1)土壤准备：采集试验点0-15cm表层土壤，过4mm筛，阴凉通风处自然风干后过2mm筛，装袋备用；

(2)植物种植：取上述制备好的土壤2000g于口径分别为17cm、12.5cm的塑料盆中，该塑料盆底部不含透水孔，在土体中均匀插入5-10根聚乙烯管，将已经发芽的玉米种子种植在塑料盆中心，待玉米长到2cm高时，挑选生长一致的玉米苗备用；

其特征在于，(3)第一次添加标记物：待挑选后的玉米苗再发芽1-2d后，选择三盆，向盆内每个聚乙烯管中添加含0.001-0.00001mmolL^-1、标记丰度为99.8％的¹³C，¹⁵N-Glycine溶液20ml，每盆共加100-200ml，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100-200ml；

(4)样品收集：在添加标记物的塑料盆中的玉米吸收4h后，尽快破坏性采样，将土壤与根系分离开来后，迅速用自来水冲洗根系，之后在超声波中清洗5min，用0.5molL^-1氯化钙冲洗三次，纯净水冲洗三次，最后放置于冻干机冷冻干燥后，称重，粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馏，最后用0.01molL^-1硫酸滴定，测定植株不同部位的¹⁵N丰度值，采集植物样品的同时，将新鲜的土壤迅速收集起来，放入4℃冰箱中保存，待试验所有土壤样品收集完成后，测定土壤鲜样中水溶性氨基酸的含量；

(5)第二次添加标记物：第一次添加标记物及超纯水3d后，进行第二次添加标记物，向每个聚乙烯管中添加含0.001-0.00001mmolL^-1的¹³C，¹⁵N-甘氨酸溶液20ml，每盆共加100-200ml，共加三盆，未加标记氨基酸溶液的其它塑料盆采用相同方法添加超纯水100-200ml，添加标记物的塑料盆，待玉米苗吸收4h后，采用步骤(4)收集样品；

(6)每隔三天重复步骤(3)和(4)，共采集植物样品15-25次；

(7)确定植物吸收分子态氨基酸：以¹⁵N吸收量为横坐标，以¹³C吸收量为纵坐标，两者进行线性拟合，得到¹³C_excess＝a¹⁵N_excess-b，如果植物吸收的氨基酸均为分子态氨基酸，则a＝2，根据实际试验得到a，与理论值2进行比较，就可以得到吸收的分子态氨基酸的比例；

(8)确定土壤中分子态氨基酸吸收速率：

Nrate=NTotal-NAsAfCSOILCb*T]]>

N_rate指的是土壤游离氨基酸的吸收速率，N_Total-N指的是每盆采集的植物样品的含氮量，A_s指的是在植物样品中由步骤(7)确定的植物吸收分子态氨基酸的氮量，A_f标记物质的¹⁵N丰度，其中甘氨酸99 .8％；C_SOIL指的是土壤中游离氨基酸的浓度；Cb指的是添加到土壤中的标记氨基酸浓度；T指的是植物吸收的时间；

(9)确定氨基酸在整个植物生长期营养贡献：由步骤(8)确定各采样时间点土壤中分子态氨基酸吸收速率后，以培养时间为横坐标，以吸收速率为纵坐标，采用微积分的方法确定氨基酸在整个植物生长期的营养贡献，吸收速率曲线与种植时间所形成的面积则为总的氨基酸吸收量；采用以下公式拟合分子态氨基酸的吸收总量：

N_吸收量(g)＝{(N_rate1+N_rate2)/2*72+(N_rate2+N_rate3)/2*72+,,,+(N_raten-1+N_raten)/2*72}*14/1000000N_rate

指的是某次取样时分子态氨基酸的吸收速率，由步骤(8)确定，N_rate1则为第一次取样时分子态氨基酸的吸收速率；

步骤(2)所述的聚乙烯管为中空的且外壁上布满小孔的聚乙烯管。

2.根据权利要求1所述的一种测定土壤氨基酸营养贡献的方法，其特征在于，步骤(4)中用球磨仪粉碎，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的¹⁵N丰度值。