[发明专利]一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法

说明书

本发明公开了一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明消除Bap2p的泛素化位点，从而解除Bap2p所受到的泛素化调控。弱化了酿酒酵母受到的泛素化调控，提高了其对支链氨基酸的利用。

技术领域

本发明涉及一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。

背景技术

转运蛋白Bap2p是一种位于细胞膜上的支链氨基酸特异性透性酶，转运的氨基酸包括亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)，对于Leu具有很高的亲和力。泛素化是蛋白质翻译后修饰的主要方式之一，被泛素标记的蛋白质将进入泛素-蛋白酶体途径，并进一步被液泡内的蛋白酶所降解。Bap2p受到泛素化调控，即Bap2p的泛素化位点(赖氨酸)被泛素所识别并标记，并最终被蛋白酶所降解。因此，解除或减轻Bap2p的泛素化修饰，从而减少其降解，将有助于其在细胞膜上的稳定存在并发挥氨基酸转运功能。

亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸为酿酒酵母非偏好型氮源，当培养基中存在偏好型氮源(谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸等)时，酿酒酵母优先利用偏好型氮源；只有当偏好型氮源耗尽时，才开始利用非偏好型氮源。酿酒酵母这种优先利用偏好型氮源的方式会带来许多不利的结果，如(1)不利于对氮源的充分利用，(2)有害代谢产物(如氨基甲酸乙酯)的积累等。因此，减弱支链氨基酸转运蛋白Bap2p受到的泛素化调控，使其能够在细胞膜上发挥稳定功能，有助于提高支链氨基酸的利用，从而有助于氮源的全面充分利用，且不会造成氨基甲酸乙酯等有害产物的积累。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法。

所述的改造转运蛋白Bap2p，是消除Bap2p的泛素化位点，从而解除Bap2p所受到的泛素化调控。

所述的消除Bap2p的泛素化位点，是将其第12和/或13和/或38和/或69位赖氨酸突变为精氨酸。

在本发明的一种实施方式中，编码所述转运蛋白Bap2p的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述的将赖氨酸突变为精氨酸，是不同的突变位点的组合。

在本发明的一种实施方式中，所述的将赖氨酸突变为精氨酸，是将第12、13、38和69位赖氨酸全部突变为精氨酸，得到突变体Bap2p^{K12,13,38,69R}。

所述的支链氨基酸指的是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。

本发明对酿酒酵母支链氨基酸转运蛋白进行了遗传改造，弱化了其受到的泛素化调控，提高了其对支链氨基酸的利用。

附图说明

图1定点突变的组合方式

图2 Bap2p系列突变体支链氨基酸利用情况

具体实施方式

材料与方法

下述实施例所用酿酒酵母菌株为S.cerevisiae CEN.PK2-1D-Δubi4(MATα ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；Δubi4::LEU2；MAL2-8^C；SUC2)单倍体模式菌株，酿酒酵母CEN.PK2-1D-Δubi4由酿酒酵母CEN.PK2-1D(MATα ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2)敲除基因UBI4改造而来，酿酒酵母CEN.PK2-1D购自EUROSCARF(Frankfurt,Germany)，其他操作均为常规分子生物学操作。

实施例1