[发明专利]一种人工合成的抗虫基因表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种人工合成的抗虫基因表达载体及其应用。本发明所提供表达载体具体为表达人工合成的抗虫基因的表达载体；所述人工合成的抗虫基因为下述a)或b)或c)的DNA分子：a)核苷酸序列如序列表中序列3所示；b)核苷酸序列如序列表中序列3的第1‑2007位所示；c)核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1‑2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质。与转入优化前Cry1Ah基因的转基因玉米相比，本发明所提供的人工合成的抗虫基因的转基因玉米，其Cry1Ah蛋白的表达量明显提高；同时抗虫性也明显提高。

技术领域

本发明涉及一种人工合成的抗虫基因表达载体及其应用，特别涉及一种根据玉米偏好密码子设计并合成的抗虫基因表达载体及其应用。

背景技术

目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如1)AT含量较高，超过60％，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’-UTR序列和3’末端的polyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001％或者几乎检测不到。

玉米螟是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米螟危害造成玉米产量损失在5％左右。我国是玉米螟的多发和重发区，20世纪70年代以来，几乎每两年就大发生一次，年损失玉米380-640万吨，相当于一个中等玉米省的产量。

由于玉米的内源抗虫性是受多基因控制的，且心叶期靶标害虫和穗期靶标害虫基因各自独立遗传，用常规育种方法培育抗螟杂交种不仅周期长，而且很难获得兼抗两个世代玉米螟的亲本。同时，玉米抗螟基因很有可能与高产性状呈负相关，20年来各国抗螟育种均未取得明显进展。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达载体。

本发明所提供的表达载体为表达人工合成的抗虫基因的表达载体；所述人工合成的抗虫基因(命名为mCry1Ah)为下述a)或b)或c)的DNA分子：

a)核苷酸序列如序列表中序列3所示；

b)核苷酸序列如序列表中序列3的第1-2007位所示；

c)核苷酸序列与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至少具有98％的同一性，且编码序列9所示蛋白质(命名为Cry1Ah蛋白)。

可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。如花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128，种子贮存蛋白质特异的启动子，例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子等。

在本发明的一个实施例中，所述表达载体中启动所述人工合成的抗虫基因的启动子具体为Ubi启动子，其核苷酸序列为序列表中序列6，或与序列6至少具有80％的同一性，且具有启动子功能。

可用于本发明的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

在本发明的一个实施例中，所述表达载体中终止所述人工合成的抗虫基因转录的转录终止序列具体如序列表中序列7所示，或与序列7至少具有80％的同一性，且具有转录终止功能的序列。