[发明专利]一种基于Pt/PdCu‑三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备及应用。具体是采用三维石墨烯负载Pt/PdCu三元合金中空纳米立方体材料，制备检测多种肿瘤标志物的夹心型电化学免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

肿瘤标志物是指存在于人体组织中可检测到的反映肿瘤存在的化学类物质。它们在正常成人组织中含量极低或者不存在，但是在患者体内其含量远远超过在正常成人的含量，他们的存在或量变表明了肿瘤性质，人们以此来了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。肿瘤标志物的快速、灵敏电化学免疫检测为肿瘤早期发现和诊断提供了可能，因此，在临床研究上，发展一种快速、简便、灵敏的检测肿瘤标志物方法是十分重要的。

目前肿瘤标志物的临床检测方法已经有很多，如放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。电化学免疫传感器是将免疫学方法与电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特性性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。

本方法采用溶剂热合成的方法，制备了三维石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方体材料，通过金属与氨键的结合，实现了检测抗体的固定，将三维石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方体材料引入传感器的制备中，构建了一种超灵敏的夹心型免疫传感器。在不使用酶的情况下，三维石墨烯负载Pt/PdCu中空纳米立方体对双氧水有良好的催化能力，并在检测过程中产生了良好的电化学信号，有效降低了传感器的检出限，可用于多种肿瘤标志物的分析。

发明内容

本发明的目的是基于三维石墨烯负载Pt/PdCu纳米立方体材料，实现了对抗体的多重标记，构建了一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。

本发明的技术方案如下：

1.一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将直径为4 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

（2）取6 µL、0.5~1.5 mg·mL^-1 环糊精功能化的石墨烯溶液滴加到电极表面，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；

（3）滴加6 µL、5~10 µg·mL^-1的抗体，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（4）滴加3 µL质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（5）滴加6 µL、0.0001~30 ng/mL的一系列不同浓度的抗原溶液，晾干后用超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；

（6）取6 µL的Pt/PdCu-三维石墨烯二抗标记物溶液，滴涂于电极表面，置于4 ℃冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三维石墨烯构建的免疫传感器。

2.一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备，所述的Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯溶液，制备步骤如下：

（1）取1.5 mL、5.7~7.7 mg·mL^-1 PdCl₂溶液，3.2 mL、7.0~9.0 mg·mL^-1氧化石墨烯溶液，10~20 mg CuSO₄·5H₂O，40~60 mg谷氨酸盐置于250 mL烧杯中，再加入35~45 mL乙二醇，超声，磁力搅拌2 h；用7~9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右；将混合溶液移入50 mL高压反应釜中，160 ˚C条件下加热6~8 h，冷却至室温；

（2）将所得物质移入含有15~25 mg谷氨酸盐，0.9 mL、2.5~3.5 mg·mL^-1H₂PtCl₆·6H₂O的乙二醇溶液的烧杯中，用7~9 wt% KOH/乙二醇溶液调节pH到13左右，然后移至反应釜，在160 ˚C下反应2.5~3.5 h；

（3）用超纯水洗涤几次，将洗涤后的物质放入冰箱中冷冻结冰，最后用冷冻干燥机干燥得到Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯。

3.一种基于Pt/PdCu纳米立方体-三维石墨烯标记的电化学免疫传感器的制备，用于各种肿瘤标志物的检测，检测步骤如下：