[发明专利]一种银杏叶提取物中有机酸含量测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于银杏叶提取物中有机酸的含量测定方法。

背景技术

银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgobiloba L.)的干燥叶，味微苦，性平，具有益心、活血止痛、敛肺平喘、化湿止泻的功效。银杏叶提取物临床上用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病。银杏叶提取物成分复杂，目前的质量控制指标仅有两类成分：黄酮醇苷类和内酯类，两者总含量为30％。另有7成成分未被列入质量标准中。已有文献报道，银杏叶提取物除了黄酮醇苷和内酯成分外，还含有原花青素、有机酸、双黄酮、异黄酮等成分。因此，为了逐步增加银杏叶提取物中的可测成分，逐步提高和完善银杏叶提取物的质量标准，对除黄酮醇苷和内酯成分之外的其他成分进行研究，就显得尤为重要。

文献“高效液相色谱法测定银杏果中有机酸的含量”(分析科学学报,2011,27(3):336-338.) 报道了白果中含有草酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸，并用一种色谱条件同时测定了这7种小分子有机酸。色谱条件流动相为3％甲醇-0.01mol/LK2HPO4，即用到了缓冲盐体系。

本发明人团队在研究中发现，虽然白果中含有上述7种小分子有机酸，但银杏叶提取物中却不含这些有机酸，但含有至少5种其他的有机酸类成分，包括莽草酸、没食子酸、原儿茶酸、6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA)和对羟基苯甲酸。这些有机酸类成分均具有较好的生物活性：莽草酸具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗血栓、抗HIV等作用，是合成抗禽流感病毒和甲型 H1N1流感病毒药物“达菲”的重要原料；没食子酸具有抗肿瘤、保肝、抗真菌感染等作用；原儿茶酸具有抗炎、保护神经细胞、抗病毒、促进干细胞增殖分化等多种功效；6-HKA是高效的谷氨酸受体拮抗剂，对神经兴奋性损伤具有很好的保护作用；对羟基苯甲酸具有抗菌消炎的作用。

在测定银杏叶提取物中的有机酸含量时，发现干扰测定最主要的成分是原花青素。因此，准确测定有机酸含量的前提是对有机酸类成分进行纯化。有机酸常用的纯化方式有两种，一是用碱水提取，提取液调酸性后用有机溶剂萃取；另一种是用阴离子交换树脂进行纯化。两者方法都用到了腐蚀性溶剂或毒性溶剂，前者包括氢氧化钠、乙酸乙酯，后者包括氢氧化钠、甲醇等。并且这两种方法都不能有效的去除银杏叶提取物中的原花青素，并且有机酸也有损失。去除原花青素最佳的方法是用聚酰胺树脂，可以完全吸附这类成分，但同时，也会损失部分有机酸，如6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA)。专利“一种天然6-羟基犬尿喹啉酸提取物的制备方法及其应用”(CN201410007590.0)说明了6-HKA必须要用含酸的70％乙醇才能将吸附在聚酰胺树脂上的6-HKA完全洗脱下来，而此时，部分原花青素成分也会被洗脱下来，从而干扰测定。大孔树脂纯化法是一种常用的纯化原花青素的方法，但原花青素的极性跨度很大，单体成分，如儿茶素微溶于冷水，而高聚体原花青素，易溶于冷水，并且原花青素的聚合度越高，极性越大，因此大孔树脂可以用于吸附原花青素，但极性较大的高聚体原花青素和有机酸成分用水或低浓度乙醇水溶液就可以洗脱下来，仍然无法完全去除干扰。综上所述，准确测定银杏叶提取物中的有机酸含量对于控制银杏叶提取物的质量，提高银杏叶提取物的标准，有着重大的意义；而找到一种去除原花青素，准确测定银杏叶提取物中有机酸的方法是目前医药行业人员极为关心的问题。

发明内容

本发明提供了一种银杏叶提取物中有机酸的含量测定方法，目的在于能够定量测定银杏叶提取物中有机酸的含量，以达到银杏叶提取物的质量更加可控的目标。

本发明所采用的技术方案具体如下：

一种银杏叶提取物中有机酸的含量测定方法，包括如下步骤：

(1)银杏叶提取物的前处理方法：取银杏叶提取物，用含牛血清白蛋白的水溶液超声提取，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物；

(2)供试品溶液的制备：有机酸提取物用含0.05～0.4％磷酸的水溶液溶解定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(3)对照品溶液的制备：精密称取莽草酸、没食子酸、原儿茶酸、6-羟基犬尿喹啉酸、对羟基苯甲酸的标准品适量，用流动相(乙腈:0.1％磷酸水溶液(V/V)：3.5:96.5)溶解，即得；

(4)高效液相色谱分析：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按如下色谱条件测定，得五种有机酸的对照品色谱图和供试品的色谱图；