[发明专利]玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子、其克隆方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子、其克隆方法及其应用。

技术背景

玉米（ZeamaysL.）是人类重要的粮食之一，并随着经济与技术的提升逐渐发展为集粮食、饲料、能源、工业原料等用途为一体的产品，全世界范围内对玉米的需求也逐年递增。而提高玉米产量，改良玉米种质成为了现阶段玉米分子育种研究的主要目标。转基因技术因其高效改良作物性状的特点成为当下热门且较为快速有效的方法之一。

启动子是基因转录起始的必须序列，含有基因表达调控的上游顺式作用元件。真核生物启动子由RNA聚合酶种类来区分可分为RNA聚合酶I、II和III识别的启动子。其中II类启动子被RNA聚合酶II识别结合，控制多种编码功能蛋白的基因表达。植物的II类启动子主要由核心启动子和上游作用元件组成。基因表达与否以及表达时间、表达部位都需要启动子的顺式作用元件与相应的转录因子协同调控。II类启动子根据控制转录水平的强度可以分为强启动子和弱启动子。根据作用方式和功能的不同，通常也将启动子分为组成型启动子、组织特异性启动子和诱导型启动子三大类。

组织特异性启动子也称为器官特异性启动子，这类启动子往往与特定器官的发育相关。目前已发现这类启动子中同时存在几种控制组织特异性表达的元件，其表达特异性由这些元件的种类、数目及相对位置等共同决定。人们正在努力寻找一些植物自身特有的组织特异启动子用于转基因载体的构建。使用组织特异启动子，可以按照人们的意愿在植物体内表达外源基因，使外源基因更为经济有效地发挥作用。深入研究组织特异性启动子不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，而且具有广泛的应用价值。

玉米种子是主要的营养贮藏器官，具有重要的经济价值。胚乳组织是种子中主要的营养储藏部位。因此，胚乳特异性启动子作为一种重要的顺式作用元件，具有实践意义和应用价值，今后在利用转基因技术来提高种子中蛋白质含量和制备植物生物反应器等方面，将会有更加广泛的应用。本发明通过生物信息学方法筛选出1个玉米胚乳特异性启动子。通过分析这个启动子可为玉米遗传转化实验提供具有价值的分子工具。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子。

本发明的目的之二在于提供该启动子序列的克隆方法。

本发明的目的之三在于提供该启动子的应用。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案:

一种玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子，其特征在于该启动子为下列序列之一：

i）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；

ii）SEQIDNO.1所示的核苷酸序列在保留核心启动子序列的基础上经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由SEQIDNO.1所示的核苷酸序列衍生的核苷酸序列。

一种载体，其特征在于该载体含有上述的玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子。

一种转基因细胞系，其特征在于该细胞系含有上述的玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子。

一种工程菌，其特征在于该工程菌含有上述的玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子。

一种克隆上述的玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子，其特征在于该方法的具体步骤为：将玉米胚乳特异表达基因NRP1的ATG上游序列截取2000bp的碱基序列，设计引物，以B73基因组为模板，通过PCR扩增即获得玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子;所述的扩增片段的引物序列：

正向引物从5′端至3′端为：agtcgtcacgctcacattgt；

反向引物从5′端至3′端为：ggctcctgctccttcactga。

一种上述的玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子在调控下游基因在玉米胚乳中的特异性表达的应用。。

本发明还提供玉米胚乳特异表达启动子NRP1启动子在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为GUS基因、GFP基因等报告基因。

将玉米NRP1基因的起始密码子(ATG)上游2kb序列扩增后，连接到GUS表达载体pTF102上，将构建好的载体转化玉米，获得转基因株系，并用GUS显示底物x-gluc对转基因植株染色，观察胚乳的着色情况。

本发明首次提出一个新的能够在玉米胚乳中特异表达的NRP1启动子，该启动子适用于启动目标基因（如GUS基因或GFP基因）在玉米胚乳中的特异性表达。该启动子的特异性很强，因此为植物基因工程表达载体的构建提供了合适的调控元件，也为实验室其他课题的研究进行提供了新的材料。