[发明专利]一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法

说明书

本发明公开了一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌特异检测。主要采用设计了一种荔枝霜疫霉菌的LAMP引物，经过恒温扩增肉眼观察或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明的LAMP引物及其用法可被用于生产实践中荔枝霜疫霉菌感染的植株中荔枝霜疫霉菌的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为荔枝霜疫霉菌引起的病害防治提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及一种荔枝霜疫霉菌LAMP引物及其快速检测方法，专用于荔枝霜疫霉菌高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间荔枝霜疫霉病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

荔枝霜疫霉病是我国荔枝产区普遍发生且危害严重的病害，其病原菌为荔枝霜疫霉菌（peronophythora litchii）。该病于1978年在我国台湾首次报道，目前在广东、广西、福建、海南 台湾等地均有发生，不仅严重为害接近成熟的果实，也为害嫩梢、叶片、花穗、结果小枝、果柄及幼果，引起大量落花、落果、裂果和烂果，产量损失高达80%以上，甚至绝收，是造成荔枝长期单产低且不稳产的主要原因之一，此外，该病在荔枝果实贮运期仍继续危害，严重影响产量、品质以及鲜果的储运和外销，造成巨大的经济损失，影响荔枝产业可持续稳定发展。

目前对荔枝霜疫霉病的检测大多仍沿用传统培养和血清学鉴定方法。传统荔枝霜疫霉菌的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，程序繁琐，所需时间较长且灵敏度较低，鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，而且不能直接从植物组织中检测出病原菌，难以满足病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期，而免疫血清学鉴定方法虽已建立，但是血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性，因此这些方法的应用均受到一定的限制。

PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，但由于目前PCR检测技术仍然需要PCR仪、电泳和凝胶成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，限制了该检测方法的推广应用。环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 具有简单、快速、高效、经济等特征。该技术可在60℃~65℃恒温条件下，利用高活性的链置换DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase)对目的DNA片段进行特异性扩增。在1个小时内，能够将少量拷贝数的目的基因扩增至10⁹个拷贝数。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real-time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR GreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后，肉眼识别。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于荔枝霜疫霉菌的LAMP检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中荔枝霜疫霉菌的生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差，灵敏度低的问题，提供一种荔枝霜疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的荔枝霜疫霉菌的快速检测方法。

实现本发明的目的包括下列步骤：

1．LAMP引物的设计