[发明专利]一种检测伏马毒素免疫亲和凝胶检测柱及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学、酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种伏马毒素免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。

背景技术

伏马毒素(Fumonisins,FBs)是霉菌毒素之一，是由串珠镰刀菌(FusariummoniliformeSheld)在特定的温度和湿度下产生的水溶性代谢产物，多见于粮食和饲料中。其结构中含有一类不同的多氢醇和丙三羧酸，使其具有生物毒性，且对热很稳定，在多数粮食加工处理过程中均比较稳定，因此其经过粮食饲料的加工生产等过程后仍可以保持其毒性，对人类及畜牧业危害较大。其在人畜体内的作用比较复杂，可以抑制N-脂酰基神经鞘氨醇合成酶的合成，从而阻断神经鞘氨醇(Sphinngosine,SO)合成，破坏鞘脂类的代谢或影响鞘脂类的功能，这一抑制可引起二氢神经鞘氨醇(Shpinganine,SA)升高，导致组织、血、尿中SA/SO比值的升高。而细胞内自由SA的聚集是有毒性的，其量的平衡与否直接决定了细胞能否存活。1993年，国际癌症研究机构研究结果为(TheInternationalAgencyforResearchonCaner)伏马毒素定位2B级致癌物质(可能是人类致癌物)，其可以引起人畜的中毒，由于人畜有种属和器官的不同，伏马毒素对不同种属的会引起其不同的病理反应，目前已知的病症主要有马脑白质软化症(EqulneLeucoencephalomalaciaELEM)，猪的肺水肿(PigPulmonaryEdema，PPE)，大鼠肝中毒及肝癌，还可以引起人类食道癌(HumanEsophagealCancer,HEC),鸡的免疫系统紊乱及致死性疾病，狒狒的心血管病变以及羊类肾病变等。因此，为了保障人民健康必须建立灵敏度高、特异性强、简单快速测定方法对伏马毒素残留进行监控。

目前报到的伏马毒素检测方法主要有：薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、免疫学检测方法等。高效液相色谱(HPLC)法准确度高，而且是目前应用最多的检测方法，但该方法存在一些缺点，如所需仪器既多又昂贵，且需专业人员进行操作，样品处理步骤繁锁，需要衍生，回收率低等问题，所以不适合广泛的推广使用。可视化快速免疫检测技术，像试纸条、凝胶检测柱等，是相对独立的快速检测方法。不需任何仪器设备，分析过程特别是前处理的步骤大大简化了，几分钟就可用肉眼观察实验结果，非常适合于大量样品的现场筛查和基层推广。因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。本论文借鉴凝胶柱免疫检测技术，为某些颜色较深及基质影响较大的样品中的伏马毒素残留检测分析，提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。

发明内容

本发明提出一种可以定性半定量的检测食品中的伏马毒素的简单、省时、灵敏的可视化免疫亲和凝胶检测柱的制备。只要样品中含有酶标记抗原，凝胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定性或半定量检测食品样品中的伏马毒素的目的。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

封闭胶的制备

(1)溶胀：称取1.00g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到80mL的配制好的HCl溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为3.5mL)。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mLHCl淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性。

(3)封闭：加入9mL甘氨酸封闭液，密封柱子，室温下震荡反应2h。

(4)清洗：首先加入10mL的偶联缓冲液淋洗一次，然后用10mL的醋酸钠缓冲溶液和10mL的偶联缓冲液分别冲洗3遍。

(5)贮存：待清洗液抽空，制备好的封闭胶用PBS悬起，约10mLPBS(含有0.3ml/L的抑菌素)，放置于4℃保存待用。

伏马毒素抗体胶和HRP抗体胶的制备

(1)溶胀：准确称取0.50g溴化氰活化琼脂糖凝胶，加入到40mL的配制好的HCL溶液中，搅拌溶胀10min(溶胀后胶的终体积约为1.8mL)。

(2)淋洗：将溶胀好的琼脂糖凝胶转移到在具砂板层析柱中，再加入200mLHCL淋洗，然后用偶联缓冲液冲洗柱子，调节柱子pH至中性，将淋洗液全部淋完。

(3)偶联抗体：取1.50mg/mL抗体，用1mL的偶联缓冲液稀释，然后加入到在具砂板层析柱中，密封柱子，室温下震荡反应2h。