[发明专利]一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用

说明书

本发明公开了一种恒温扩增核酸的方法及应用，所述方法对传统LAMP扩增原理进行改进，包括六条核心引物，四条为内引物，命名为FIP1，FIP2，BIP1和BIP2；两条为外引物，命名为F3和B3，另外的四条环引物加入到反应体系中以加速扩增反应。本方法的扩增结果可以进行可视化检测，电泳检测或实时浊度检测。本发明提供的方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

技术领域

本发明涉及一种新的恒温扩增技术及在细菌检测中的应用，特别是在单增李斯特菌鉴定中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

环介导恒温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是由Notomi等建立的一种体外核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、产物易检测等优点。该技术已被广泛用于分子鉴定领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设计4条核心引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(Forward Inner Primer，FIP)和BIP(Backward Inner Primer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列)，即5′-Flc-F2；BIP包含B1c(B1区域的互补序列)和B2，即5′-Blc-B2。其余两条核心引物为外引物F3和B3。另外的两条环引物(Loop Primes,LF和LB)被增加到反应体系中加速LAMP反应。

LAMP反应包括两个过程，即哑铃状模板合成阶段和循环扩增阶段。LAMP反应的温度为60～65℃，该温度是双链DNA复性及延伸的中间温度，双链DNA在该温度范围内处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换Bst DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前端F3c序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出FIP引物合成的DNA链，同时合成自身DNA，最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然后由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，该单链通过5′末端的F1c区段和F1区段互补，发生自我碱基配对，形成茎环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交结合，以BIP引物的3′端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。接着，B3引物与BIP引物外侧的互补区域B3c配对结合，以3′端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互补链。通过上述2个过程，形成双链DNA。被置换的单链DNA依据两端存在的互补区域，发生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条被置换出来的DNA在两端呈现哑铃状结构，该结构作为LAMP反应扩增循环的起始结构。LAMP反应扩增循环阶段：首先在哑铃状结构中，以3′末端的Fl区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应，解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其杂交，启动新一轮扩增，经过相同的过程，又形成茎环结构。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA，在1小时之内使产物的量达到10⁹个拷贝。

LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法是直接在产物中加入SYBR Green Ⅰ染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。