[发明专利]结核分枝杆菌rpoB突变基因及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌rpoB突变基因，以及用于检测导致结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变c.1843G>A的试剂盒，属于结核病耐药基因突变检测技术领域。

背景技术

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）引起的慢性传染病。主要累及脏器为肺，此外还会侵犯皮肤、骨骼等全身多个组织和器官。目前，我国结核病患者数居世界第二位，而耐药率居全球第一。约2/3的结核病患者处于发生耐多药结核病（multi-drugresistancetuberculosis，MDR-TB）至少对利福平（rifampicin，RFP）和异烟肼（Isoniazid，INH）同时耐药的危险之中）。据报道我国每年新发耐多药结核病患者多达15万，给结核病患者治愈带来巨大挑战。而耐利福平MTB菌株的传播往往是结核病短程化疗失败的主要原因之一。

自1971年发现利福平具有全效能杀结核分枝杆菌复合物以来，利福平一直是结核病化疗方案中的一个关键药物。目前研究表明利福平对生长和静止期的结核菌具有很强的杀伤效果，该药物的应用使临床治愈结核病患者周期由12-18月缩减至9个月。利福平通过与RNA聚合酶的β亚基结合，干扰RNA链的开始和延伸，阻止RNA的合成。而编码结核分枝杆菌RNA聚合酶的β亚基的基因为rpoB基因，该基因的突变直接影响利福平治疗结核患者的效果。该基因热点突变区域（突变发生率为90-95%）主要集中在长81bp（对应编码507-533位氨基酸）的核心区域-耐利福平决定区（rifampicinresistance-determiningregion，RRDR），包括点突变或短的插入、缺失突变等，使DNA依赖性RNA聚合酶B亚单位酶活性改变，利福平不能与RNA聚合酶B亚单位结合而表现为耐药。

进入21世纪以来，由于抗生素滥用、环境污染和艾滋病患者增多等原因，结核作为机会性致病菌，其发病率呈现逐年增多的趋势。因此对结核患者早期进行诊断，并且对耐药结核患者的具体耐药机制进行确诊，提前调整对该类患者的临床用药，将大大缩短临床诊断时间，有助于早期发现其耐药机制，特别是对一些耐多药患者进行突变热点的基因诊断，从而采取有效的临床治疗措施，将大大提高该类患者的治愈率。利福平与异酰肼搭配治疗方案是临床常用治疗结核病患者主要手段，也是一线常规用药，因此对结核杆菌耐利福平rpoB基因的突变热点区进行基因检测，将有利于临床快速诊断和治疗。

经文献检索，未见与本发明检测突变位点相同的公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的方法，该结核分枝杆菌rpoB突变基因具有c.1843G>A突变位点，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。

本发明另一目的是提供用于检测结核分枝杆菌rpoB突变基因的试剂盒，该试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌rpoB基因c.1843G>A突变的试剂。

所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的引物。

本发明通过检测来自耐利福平结核菌株的样本中是否存在rpoB基因的c.1843G>A突变（根据大肠杆菌该基因位点定位），从而判断该患者耐利福平药物的耐药分子机制。其中c.1843G>A突变位点为rpoB基因的突变，该突变导致rpoB基因第615位的缬氨酸（Val）突变为甲硫氨酸（Met）。这个氨基酸的改变，影响了药物利福平转化为活性物质成分，发挥其抗结核分枝杆菌的作用，从而使该菌株产生耐药。

发明人用候选基因筛查的方法，在中国33株耐利福平结核菌株中进行检测，在一株耐药结核菌种发现与耐利福平相关的rpoB基因新突变c.1843G>A；该突变的频率为3.03%，这说明在耐利福平的结核菌株中，rpoB基因突变c.1843G>A具有一定的发生频率，因此rpoB基因突变c.1843G>A可以作为临床利福平耐药菌株耐药分子机制的诊断依据。并且目前，在国际和国内均未见该突变的报道。

本发明用于检测rpoB基因突变c.1843G>A的试剂盒，包括用于检测rpoB基因的突变c.1843G>A所需的试剂和能选用的用于扩增rpoB基因的试剂和PCR引物。

用于检测rpoB基因突变c.1843G>A的试剂盒，包括以下一种或几种试剂的组合：

（1）从待检样品中提取DNA的试剂；