[发明专利]一株分泌抗WT1蛋白的单克隆抗体及其应用

说明书

本发明涉及一株分泌抗WT1蛋白的单克隆抗体及其应用。WT1蛋白是Wilms本发明通过对WT1蛋白分析后制备重组可溶蛋白并经动物免疫和筛选获得了一株可分泌IgG1亚型的单克隆抗体的细胞株60660‑2C10，其亲和常数为3.84×10⁹。免疫印记（Western blotting）实验显示该抗体能特异识别重组的WT1蛋白以及表达WT1蛋白的肾母细胞瘤组织。该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中WT1蛋白的表达水平，可以用于肾母细胞瘤、卵巢癌和乳腺癌的免疫学诊断和分级。

技术领域

本发明涉及一种可以识别人WT1蛋白质分子的单克隆分子及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞表面抗原WT1分子的单克隆抗体，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中WT1蛋白的表达水平，从而用于对这些肿瘤进行诊断的方法中，属于生物检测领域。

背景技术

肾母细胞瘤是最常见的腹部恶性肿瘤，其发病率在小儿腹部肿瘤中占首位。肿瘤主要发生在生后最初5年内，特别多见于2～4岁。Wilms肿瘤基因(Wilms' tumor gene,wt1)是与Wilms肿瘤的发生、发展有关的基因，最初发现，其等位基因的功能缺失可导致肾母细胞瘤(Wilms tumor)。WT1蛋白可以抑制胰岛素样生长因子Ⅱ、集落刺激因子、Pax2等多种生长因子及受体基因的转录，最先被认为是一种肿瘤抑制基因。近来认为WT1还具有激活基因转录的功能，有类癌基因样活性，在肿瘤的发生中起一定作用。并且发现WT1在白血病细胞中高度表达并与白血病的发生、发展及预后有关。发现在急性髓系白血病（AML）中序列特异性的转录因子WT1以一种与TET2、IDH1和IDH2相互排斥的方式发生了突变。他们证实通常情况下，WT1可与TET2发生物理互作并将TET2招募至靶基因处激活它们表达。TET2以一种依赖于WT1的形式抑制了白血病细胞增殖及克隆形成。而多个源自AML的TET2突变则破坏了WT1与TET2之间的互作。对494例肿瘤样本的研究发现，该蛋白的表达与胃癌、前列腺癌及白血病的发生有关。在富含血管的乳腺癌组织和卵巢癌组织以及内皮细胞中的表达情况及可能的用途也有研究。WT1可以与P53、EGFR等标志物一同作为一种卵巢癌诊断和分型的工具。

对于肾母细胞瘤的诊断，过去以影像学方法为主，但部分病例肾功能减退或完全不显影，需应用大剂量造影剂造影。此外结合利用超声方法检查将有助于鉴别肾积水与肿瘤。而CT检查有助于确定肿瘤侵染的范围。在与神经母细胞瘤等肿瘤鉴别分析时，可进行骨髓穿刺，尿VMA、HVA定量，血清乳酸脱氢酶（LDH），甲胎蛋白（AFP）定量，神经元特异性烯醇化酶（NSE）定量等检查。获得高灵敏度和高特异性的WT1抗体是免疫诊断方法的基础，目前可以通过商业途径获得针对WT1的多克隆抗体或者单克隆抗体，部分抗体的制备采用的是WT1蛋白的C末端多肽作为免疫原，部分采用的是截取的蛋白片段。目前使用较多的一株抗体为6F-H2（DAKO），该抗体由重组蛋白作为抗原免疫小鼠获得，其所识别的抗原表位位于蛋白的N端的1-84位区域。在对多种肿瘤的诊断价值研究中，发现该单克隆抗体与多克隆抗体（c19，同为DAKO产品）相比，对于肾母细胞瘤的判别有所不同，6F-H2的阳性率为36%, 而多单克隆抗体为47%，阳性率的差别反应了单克隆抗体识别表位的专一性，但也限制了因亲合力不同导致的敏感度下降。

针对以上研究现状，我们将发现适宜IHC诊断抗体开发的WT1重组抗原制备和WT1抗体筛选方法，并通过组织芯片技术收集大样本的病例，进行免疫组织化学检测，探明WT-1抗体在肾母细胞瘤、乳腺癌和卵巢癌诊断和分型、分级中的应用价值。

发明内容