[发明专利]牛肉制品中猪肉成分定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体涉及牛肉制品中猪肉成分含量定量检测方法。

背景技术

由于猪肉与牛肉、羊肉价格差别较大，近年来在经济利益的驱动下，以猪肉添加牛肉香精、羊油、色素等添加剂冒充羊肉、牛肉及其制品的违法犯罪事件屡见不鲜。如浙江犯罪团伙用猪肉生产假牛肉干，一年多制造销售达75吨；广州思味食品的“亿思”牌牛肉干以猪肉和牛肉膏为原料，以假充真，两年销售2000万元；内蒙古不法分子猪肉冒充牛肉，添加牛肉香精，将生产的假风干牛肉销往包头周边地区及陕西、宁夏等省市。这些事件损坏了消费者的利益，甚至危害消费者身体健康。而且因穆斯林忌食猪肉，这些假牛羊肉也涉及到民族和宗教问题。这些都严重动摇了消费者对食品行业的信心。

由于经过色素、香精加工的猪肉纹理、色泽和气味与牛肉、羊肉相似，普通消费者难以辨别，深加工过的假牛肉干等制品更是难以分辨。目前肉类成分鉴定的方法主要是根据蛋白质成分和基因序列，如色谱、酶联免疫反应(ELISA)和聚合酶链式反应(PCR)法。目前一些企业已经开发出猪肉蛋白质的ELISA检测试剂盒和试剂条，但这些试剂盒和试剂条检测准确性不高。实时荧光PCR(real-timePCR)方法具有灵敏度、准确性高的优点，同时不需要购买昂贵的试剂盒。目前肉类成分食品检测标准主要基于实时荧光PCR方法，如SN/T3730.8-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第8部分猪成分检测实时荧光PCR法》。

但这些标准主要是对食品和饲料中猪、牛、鸡等动物源成分进行定性检测，不能进行定量检测，无法依据阳性结果判断是因为生产者故意掺假还是生产中污染造成。同时因为大部分检测标准的目标基因是18SrRNA等多拷贝基因，检测灵敏度非常高(可检出0.001％特定动物源性成分)，容易出现假阳性结果。这些缺点限制使这些检测标准无法作为判断是否惨假的依据，因此急需一种准确快速的猪肉成分定量检测方法作为肉类惨假判定的依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供牛肉制品中猪肉成分定量检测方法。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

牛肉制品中猪肉成分定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，样品预处理；

步骤二，DNA抽取；

步骤三，DNA浓度和纯度的测定；

步骤四，实时荧光PCR反应；

步骤五，结果计算。

本发明进行牛肉制品中猪肉成分含量定量检测，检测过程简便，结果准确，并且提取的猪肉浓度参考物质DNA可以长时间保持，与购买商业试剂盒相比，成本低廉，满足了猪肉掺假鉴定的需要。

所述步骤一中，所述样品为干燥固体时，可直接以粉碎机研磨成细粉；所述样品为湿状时，经冷冻干燥处理后，再研磨成细粉备用。

作为一种方案，所述步骤二中，包括2-1：称取两个0.2g样品试样，至2ml离心管中，加入900μL预热的CTAB裂解缓冲液和40μL蛋白酶K，轻轻混匀后，65℃水浴保温30min；

2-2：12000g离心5min，取上清于另一干净的2ml离心管中，加入等体积的酚，三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；

2-3：12000g离心5min，取上清至干净的2ml离心管中，加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(24:1)，颠倒混匀，12000g离心10min，取上清至干净的2ml离心管中；

2-4：加入等体积异丙醇，颠倒混匀，12000g离心5min，弃去上清液；E.用4℃预冷的70％乙醇500μL，涡旋清洗沉淀，12000g离心5min，弃去上清液；

2-5：倒置晒干后加100μLRNA酶A缓冲液，37℃温育30min；

2-6：重复步骤2-4、2-5，倒置晒干后加50μLTE缓冲液溶解沉淀，-20℃保存备用。

作为另一种方案，所述步骤二中，也可使用商品化DNA提取试剂盒提取DNA。

所述步骤三中，使用紫外分光光度计检测提取的DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值应在1.7～2.0之间，按以下公式计算DNA浓度：

C＝A*N*50

C—DNA浓度，单位为ng/μL；

A—260nm处的吸光值

N—DNA稀释倍数

将DNA浓度稀释到50ng/μL。