[发明专利]基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒，尤其是涉及一种基于二代测序平台对结肠癌患者微卫星不稳定性进行检测的检测试剂盒。

背景技术

结直肠癌发病率在我国高居各类癌症发病率的第3位，占癌症死因的第5位，其根治性切除后5年生存率为50％左右，术后复发和转移是其死亡的重要原因。早期结肠癌患者通常可借手术切除，一旦转移，其治疗的方法并不多，患者五年生存率也不理想。研究发现，基因组的不稳定性与结直肠癌的发病机理密切相关，基因组的不稳定性包括染色体不稳定性(chromosomalinstability，CI)和微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)。

微卫星是指基因上含有重复的DNA短小序列或单核苷酸区域。在肿瘤细胞中，当DNA发生甲基化或基因突变致错配修复基因缺失时,可导致微卫星重复序列错配(微卫星突变)，导致其序列缩短或延长，从而引起微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)。根据MSI不稳定性的程度，可分为高不稳定性(MSI-H)和低不稳定性(MSI-L),正常情况下称为微卫星稳定(microsatellitestability，MSS)。

大量研究表明，MSI参与恶性肿瘤的发生发展过程，与结肠癌、胃癌、子宫内膜癌等等发生密切相关。约15％的结直肠癌患者存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynonpolyposiscolerectalcancer,HNPCC)患者90％以上为MSI瘤，表明MSI可作为检测是否为HNPCC患者的重要标志物；与MSS(即微卫星稳定)的结肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌患者其预后更好，并且二者药物反应也不一样，提示MSI可作为结直肠癌预后的独立预测因子，因此，MSI检测对结直肠癌患者意义重大。

美国国家肿瘤研究所(NationalCancerInstitute，NCI)曾经通过一个针对肿瘤的微卫星不稳定及复制错误表型检测的国际专题会议制定了MSI检测的统一标准(即BethesdaGuidelines)，作为涉及检测MSI的参考Panel(即NCIPanel)，它包含2个单核苷酸重复的位点(BAT-25、BAT-26)和3个2核苷酸重复的位点(D2S123、D5S346、D17S250)。据此对肿瘤MSI状态进行检测时，5个STR位点如果检测出2个或2个以上的位点有MSI，则为MSI-H，MSI-H肿瘤表现出特有的临床及病理学表型；若只检测出1个位点有MSI，则为MSI-L，无任何位点变化者为MSS。然而，MSI-L与MSS的肿瘤表型差异不大，要区别MSI-L与MSS的肿瘤表型，需要选用更多位点来进行检测时才能实现。

在2002年的第二次相关专题会议上，针对之前采纳的检测MSI的参考Panel来检测MSI出现了争议，因为NCIPanel使用的3个2核苷酸重复的位点具有高多态性的特征，在检测时必须用与肿瘤组织相匹配的正常组织来作比较才能得出结果，使其在检测存在错配修复缺陷的肿瘤时表现出较低的特异性和灵敏度。因此采用NCIPanel来检测MSI存在一定的局限性，大会建议增加单核苷酸重复位点来检测MSI以提高检测的灵敏度。

2015年最新发布的药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)中明确规定，MSI的检测可用于氟尿嘧啶类药物的辅助疗效预测。近期研究发现，MSI-H较MSI-L和MSS的结肠癌患者在接受PD-1抗体〔即FDA批准的两种免疫检查点抑制药物(Nivolumab(MDX1106)和Pembrolizumab)〕治疗后具有更好的临床反应性，表明结直肠癌患者的MSI水平可作为一个对PD-1/PD-L1抗体响应的独立预测因子来预测筛选从PD-1抗体免疫治疗获益的结肠癌患者群体。对检测结直肠癌患者的MSI水平，可用于免疫检查点抑制剂类药物的辅助疗效预测。

因此，建立MSI检测体系以寻找高度灵敏性及特异性的用来检测MSI的相关位点已成为近年来研究MSI检测领域的热点。

现有检测MSI的方法主要为：

1)免疫组化方法，该方法仅用于肿瘤细胞中的MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白结合，如果没有结合任何的蛋白，则证明发生了MSI；该方法的灵敏度虽然接近90％，但特异性和可重复性较低，操作比较复杂；