[发明专利]NK细胞的体外三维扩增培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程和生物医药领域，特别涉及一种NK细胞的体外三维扩增培养方法。

背景技术

自然杀伤细胞(Naturalkillercells,NK细胞)，作为与T细胞、B细胞并列的一大类淋巴细胞群体，是天然免疫系统的重要成员。NK细胞除了参与先天性免疫应答之外，还在适应性免疫的免疫调节中起着重要的调控作用。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等，因此，NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素，也参与第Ⅱ型超敏反应和移植物抗宿主反应。综上，NK细胞的离体扩增和激活时促进临床频繁应用的关键，而目前NK细胞的扩增方法主要包括在二维培养前分离NK前体或CD56以及使用饲养细胞等步骤，不仅需要饲养细胞、操作较繁琐，而且NK细胞的扩增效果不明显，且所获得的NK细胞杀伤活性较差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术于二维环境中扩增NK细胞存在NK细胞扩增率低且杀伤活性差等缺陷，提供一种能够提高NK细胞扩增率及杀伤活性的NK细胞的体外三维扩增培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种NK细胞的体外三维扩增培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

获取NK细胞；

将所述NK细胞接种于三维培养支架中进行体外三维扩增培养；其中，三维培养支架为壳聚糖-海藻酸钠支架。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述壳聚糖-海藻酸钠支架的制备过程，包括以下步骤：

取海藻酸钠溶于蒸馏水中，壳聚糖溶于醋酸溶液中，加热溶胀；用冰醋酸分别调节壳聚糖和海藻酸钠溶液的pH至3.0～5.0后，混合均匀，真空脱泡后于-5℃--198℃下冷冻并冻干。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述壳聚糖-海藻酸钠支架的制备过程，还包括在壳聚糖和海藻酸钠溶液混合后，添加除镁离子以外的二价金属离子盐溶液的步骤。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，获取NK细胞的过程，包括以下步骤：

获取CD34⁺造血干细胞于含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基中进行刺激分化成NK细胞。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述造血干细胞生长因子包括白介素-2、白介素-12、白介素-15以及白介素-18。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述干细胞培养基中，白介素2的浓度为100-300U/ml、IL-12的浓度为0.5-4.5ng/ml、白介素-15的浓度为2-8ng/ml以及白介素-18的浓度为5-15ng/ml。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述造血干细胞生长因子包括白介素-2，且所述造血干细胞生长因子中还添加有抗CD3单克隆抗体。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述干细胞培养基中，白介素-2的浓度为5-15ng/ml、抗CD3单克隆抗体的浓度为5-15ng/ml。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，对所述NK细胞进行体外扩增培养的步骤为：将所述壳聚糖-海藻酸钠研碎加入乙酸中复溶，并添加所述含有造血干细胞生长因子的干细胞培养基，接种所述NK细胞进行培养20-50天。

在本发明提供的NK细胞的体外三维扩增培养方法中，所述CD34⁺造血干细胞的获取过程，包括以下步骤：

从血细胞中分离出单个核细胞，经磁珠分选出CD34⁺造血干细胞。

实施本发明提供的NK细胞体外扩增培养方法，可以达到以下有益效果：本发明通过采用壳聚糖-海藻酸钠支架对NK细胞进行扩增培养，利用壳聚糖-海藻酸钠支架的多孔隙结构及其机械性能和生物相容性，扩大了NK细胞的生长空间及与营养物质的接触面积，也可使得NK细胞能够均匀分布在壳聚糖-海藻酸钠支架中，避免细胞聚集成团，促进NK细胞与营养物质的接触，从而能够提高NK细胞的细胞活性，有利于提高NK细胞的扩增率及其杀伤活性；从而解决了现有技术中采用饲养细胞于二维环境中培养NK细胞存在的NK细胞活性差、扩增率低等缺陷模拟NK细胞生长的微环境。

具体实施方式