[发明专利]一种新型水溶性免疫佐剂棘球蚴疫苗

权利要求书

1.一种棘球蚴疫苗，其中包括可溶性表达的Eg95重组蛋白和氢氧化铝免疫佐剂。

2.权利要求1所述的棘球蚴疫苗，其中可溶性表达的Eg95重组蛋白及氢氧化铝免疫佐剂按体积比5：1进行混合。

3.权利要求1或2所述的棘球蚴疫苗，其中所述的EG95重组蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。

4.权利要求1至3任一项所述的棘球蚴疫苗，其中所述的EG95重组蛋白编码基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。

5.用于制备截短的羊包虫EG95可溶性抗原的引物对，其中所包括的上、下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。

6.权利要求5所述的引物对在制备截短的羊包虫EG95可溶性抗原中的用途。

7.一种制备棘球蚴疫苗的方法，该方法包括：(a)PCR扩增获得截短的羊包虫EG95编码基因；(b)重组表达步骤(a)获得的编码基因得到重组蛋白；(c)将步骤(b)获得的重组蛋白进行纯化得到羊包虫EG95可溶性重组抗原；(d)将EG95可溶性重组抗原及氢氧化铝免疫佐剂按体积比5:1混合。

8.权利要求7所述的制备棘球蚴疫苗的方法，步骤(b)中的重组表达的具体操作为：将含SEQIDNO:1、的重组质粒PET分别转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落接种至10mL含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养过夜，将1ml培养物接种于100ml含终浓度25μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃200r/min震荡培养至OD₆₀₀nm＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，22℃，160rpm震荡培养10h；6000r/min离心10min收集菌体，用pH7.4的PBS40mL洗涤两次，用pH7.4的PBS10ml重悬后，冰浴超声破碎菌体，破碎后混合物经12000rpm，4℃离心30min后取上清。

9.权利要求7或8所述的制备棘球蚴疫苗的方法，步骤(b)步骤(c)中重组蛋白的纯化具体操作为：将蛋白上清液经φ0.22μm滤膜过滤，用金属镍亲和层析柱按操作手册在蛋白纯化仪进行纯化，并用脱盐层析柱进行脱盐，将重组蛋白置换到PBS(pH7.4)缓冲溶液中。

10.一种用于检测EG95抗体的ELISA方法，该方法包括下述步骤：(1)用碳酸盐缓冲液稀释EG95包被抗原，包被ELISA板过夜；(2)用PBS-吐温20洗液，洗涤酶标板3次，每次3分钟；(3)每孔加入200μl封闭液，37℃1小时，进行封闭；(4)重复(2)进行洗板；(5)将待检血清应进行1:200倍稀释，每孔加入经过稀释的被检血清100μl，37℃45分钟，同时设阳性血清和阴性血清对照；(6)重复(2)进行洗板；(7)将兔抗羊IgGHPR按使用说明书进行稀释，每孔100μl，37℃45分钟；(8)重复(2)进行洗版；(9)每孔加入100μlOPD底物溶液，37℃15分钟；(10)每孔加入1M硫酸50μl终止反应；(11)在492nm处用酶标读数仪测定OD值；该方法判定标准为：当10只注射被检疫苗二免后2周试验羊血清有8只以上血清OD值≥1.0时，且10只注射被检疫苗二免后2周试验羊血清P/N值均≥2.0，视为疫苗免疫后已产生有效抗体，被检疫苗判为合格，否则，为不合格。