[发明专利]一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断的同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法，其特征在于，包括以下各步骤：

(1)胚胎细胞样本的获得：通过单精子注射获得受精卵，培养至囊胚期在外滋养层细胞分离获得包含3-10个细胞的样本，所述胚胎细胞为非人的其他哺乳动物的胚胎细胞；

(2)全基因组扩增：在样本中加入裂解液放入PCR仪中进行裂解、失活蛋白酶，对获得的细胞裂解样本进行全基因组扩增；

(3)目的基因突变位点扩增：在完成引物设计、引物评估之后，将目的基因突变位点进行普通PCR扩增获得PCR产物，将同一样本的PCR产物与步骤(2)中获得的片段化的基因组DNA按照一定比例混合；

(4)全基因组扩增产物与目的基因突变位点进行建库；

(5)采用高通量测序平台，对样本进行测序；

(6)数据分析

(6.1)将步骤(5)获得的测序结果去掉接头以及低质量数据，采用比对软件比对到参考基因组；

(6.2)下机的数据经质控后比对到参考序列上，统计位点的等位基因的分布及其频率，检测目的基因位点突变信息；

(6.3)下机的数据经质控后比对到参考序列上，序列按照一定窗口进行GC矫正，以几千例全基因组扩增的单细胞数据为数据库进行修正，最终检测出染色体拷贝数变异(CNV)；

(6.4)采用SNP-单体型进行连锁分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的全基因组扩增由多重退火环状扩增技术(MALBAC)实现，包括第一轮线性扩增和第二轮指数扩增。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一轮线性扩增的条件为：

(1)90-98℃反应90s-5min；

(2)15-25℃反应30s-1min；

(3)25-35℃反应30s-1min；

(4)35-45℃反应20s-1min；

(5)45-55℃反应20s-1min；

(6)55-65℃反应20s-1min；

(7)65-85℃反应2min-6min；

(8)90-98℃反应10-40s；

(9)45-65℃反应5-20s；

(10)重复步骤(2)到步骤(9)5至20个循环。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一轮线性扩增的条件优选为：

(1)94℃反应3min；

(2)20℃反应40s；

(3)30℃反应40s；

(4)40℃反应30s；

(5)50℃反应30s；

(6)60℃反应30s；

(7)70℃反应4min；

(8)95℃反应20s；

(9)58℃反应10s；

(10)重复步骤(2)到步骤(9)8个循环。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第二轮指数扩增的条件为：

(1)90-98℃反应10s-50s；

(2)90-98℃反应10s-40s；

(3)45-65℃反应20s-45s；

(4)65-80℃反应75s-5min；

(5)重复步骤(2)到步骤(4)10至30个循环；

(6)将扩增后的产物在0-5℃保存。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第二轮指数扩增的条件优选为：

(1)94℃反应30s；

(2)94℃反应20s；

(3)58℃反应30s；

(4)72℃反应3min；

(5)重复步骤(2)到步骤(4)17个循环；

(6)将扩增后的产物在4℃保存。

7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，MALBAC扩增后的产物在300-2000bp之间。