[发明专利]一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及酶法同型半胱氨酸检测技术领域，特别涉及一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂。

背景技术

血浆同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)即2-氨酸-4巯基丁酸，为一种含硫氨基酸，又称为高半胱氨酸，HCY是蛋氨酸循环中S-腺苷基高半胱氨酸水解酶，水解反应的产物，细胞内的HCY有三条去路即被甲基化生成蛋氨酸，与丝氨酸缩合生成胱硫醚以及直接排出。细胞HCY是蛋氨酸新陈代谢过程中的重要中间产物，是一种有毒性作用的含硫氨基酸。血浆中HCY存在游离态与结合态两种形式。在生理条件下，人体血浆中只有极少量HCY(<0.3μmol/L)以游离状态存在，绝大部分以HCY-二硫化合物结合态存在，而结合态HCY中约70%与血浆蛋白结合，其余30%与其他硫醇结合。血浆中Hcy参考范围与年龄有关，成人≤15μmol/L，60岁以上老年人为15~20μmol/L。

当Hcy的浓度高于正常范围时，会对人体产生多方面的影响，例如：加速氧化及衰老，心血管疾病，免疫力减弱，大脑的损伤，增加疼痛、炎症及血栓等。因此，同型半胱氨酸含量是人体的重要健康指标。

临床上常用的同型半胱氨酸检测方法有荧光偏振免疫法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定和循环酶法。

1.荧光偏振免疫法

用二硫苏糖醇(dithiothrepitol)将样本还原，然后Hcy在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的催化下与腺苷生成S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，最后将预稀释的SAH混合物、抗-SAH单克隆抗体及带有荧光标记的S-腺苷-L-同型半胱氨酸示踪物一同孵育，用自动免疫分析仪检测偏振光的改变，标准曲线法定量。该方法操作简单，与胱氨酸和蛋氨酸无交差反应。该方法具有良好的稳定性、线性及重复性。

2.高效液相色谱法

血液标本以乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝，3000转离心2min，高氯酸沉淀蛋白质，上清液与NaBH4溶液起反应，还原二硫键，一根0.2cm×50cm装有Zi-paxSCX强阳离子交换树脂的柱子用来分离同型半胱氨酸，混合物以0.031M磷酸盐、0.118M柠檬酸缓冲液以0.75ml/M的流速洗脱，用对硫化物具有高度敏感性和特异性的金-水银薄层电化学检测仪对同型半胱氨酸进行检测。具有样本处理简单，无需衍生等特点，又具较高的灵敏性、专一性和稳定性。

3.酶联免疫吸附测定

通过特异的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶催化Hcy转变为SAH，然后加入辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，最后加入辣根过氧化物酶的底物和四甲基联苯胺呈色，以硫酸终止反应后在450nm处比色，标本中总Hcy与OD值呈负相关。

4.循环酶法

标本在TECP的作用下，氧化型同型半胱氨酸转化为游离型Hcy，游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionineSAM)在同型半胱氨酸甲基转移酶的催化反应形成蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循环的加入反应，从而放大了检测信号，生成物腺苷(Ado)立即水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD+，样本中的Hcy的浓度与NADH的变化成正比。循环酶法在全自动生化仪上可以更加简便、灵敏、准确的检测Hcy，方法是国内常用的方法。

发明内容

本发明在在循环酶法的基础上，优化反应体系，添加多种稳定剂，显著改善了试剂的稳定性。

针对于同型半胱氨酸检测，本发明提供了一种稳定性强的酶法同型半胱氨酸检测试剂盒，该试剂盒使用简单、方便，具有很好的准确度、重复性及良好的检测范围，有利于试剂在临床上的推广应用。

基本原理

基于小分子捕获技术(SMT)的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。Hcy被转化为游离型后，通过与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD，样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种同型半胱氨酸检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

R1：

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)0.1mmol/L

NADH0.3mmol/L

三(2羧乙基)膦氯化氢(TCEP)0.1mmol/L

α-酮戊二酸5.0mmol/L

叠氮钠0.5g/L

R2：